химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

альна количеству краски, соединившейся с белком дайной фракции. Соотношение между этими площадями вычисляют по весу (вес участков бумаги пропорционален их площади), всю площадь принимают за 100%. При наличии денситометра соотношение белковых фракций в сыворотке крови можно определить из денси-тограммы.

Рис 9 Электрофореграмма сыворотки крови человека (А) и кривая распределения белковых фракций на электрофореграмме (Б)

Предварительно определяя содержание белка в сыворотке, рассчитывают его количество для каждой фракции.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В АГАРОВОМ ГЕЛЕ

Подобно крахмальному и акриламидному агаровый гель является очень мягким носителем: в отличие от электрофореза на бумаге при нем не происходит инактивации белков, что позволяет определять активность отдельных фракций белков непосредственно в геле после проведения электрофореза. Приготовление агарового геля значительно проще, чем крахмального или полиакриламидного, продолжительность электрофореза составляет 1—4 ч.

Студентам предлагается провести электрофоретическое разделение белков сыворотки крови.

Электрофорез сыворотки крови проводят в 1%-ном агаре в ме-динал-вероналовом буфере (рН 8,6) с ионной силой 0,05. Все белки сыворотки при рН 8,6 заряжаются отрицательно и перемещаются в электрическом поле в сторону анода. Однако практически медленно продвигающиеся фракции белков сыворотки обычно движутся в сторону катода. Аномальное движение этих фракций объясняется наличием в агаровом геле электроэндоосмотического тока жидкости, направленного в описанных выше условиях от анода к катоду, а также тока жидкости, возникающего при неравномерном испарении воды с поверхности геля. Неравномерное испарение приводит к неравномерному распределению электрического поля в нем. Уменьшить испарение воды можно двумя способами: 1) герметически закрывая электрофоретическую камеру во время электрофореза, 2) проводя электрофорез при низкой температуре (в холодильнике или холодной комнате, буферный раствор должен быть заранее охлажден).

Реактивы:

1. Мединал-вероналовый буфер (рН 8,6; ионная сила 0,1): в 500 мл воды растворяют 17,52 г мединала, добавляют 2,76 г веронала и, помешивая, нагревают в теплой водяной бане до растворения веронала. Затем раствор доводят дистиллированной водой до 1 л.

2. Агйр — 1%-ный раствор. Агар должен быть чистым и прозрачным. Для его очистки из коммерческого препарата готовят 2%-ный раствор на дистиллированной воде. Горячий раствор разливают в ванночки слоем толщиной в 1 —1,5 см. После застывания агаровую пластинку разрезают на кубики, помещают их в толстостенный стакан и промывают в течение двух суток под струей водопроводной воды, затем в течение суток — дистиллированной водой, сменив ее 4—5 раз. Агар обсушивают фильтровальной бумагой, помещают в колбу, разогревают, горячий раствор разводят в 2 раза буферным раствором и трижды фильтруют через 3 слоя марли. Раствор агара хранят в холодильнике. Перед нанесением на пластинки его нагревают на кипящей водяной бане, пока он не станет свободным от пузырьков воздуха.

3. Амиловый черный 10 Б — 0,1%-ный раствор в 2%-ной СНзСООН.

4. СНзСООН — 5%-ный раствор.

Приготовление агаровых пластинок и проведение электрофореза.

Для приготовления агаровых пластинок используют предметные стекла. Предварительно их обезжиривают, тщательно промывают водой и высушивают. Стекла нумеруют, укладывают на строго горизонтальную поверхность и на каждое осторожно наливают пипеткой с широким концом 4 мл агара. Пузырьки воздуха в агаре необходимо вывести пипеткой на края стекла. Когда агар застынет и образуется твердый гель, в нем посередине вырезают лунку (щель) для нанесения исследуемого раствора. Приготовленные пластинки укладывают в электрофоретичес-кую камеру. Агаровое плато соединяют с буферным раствором «бумажными мостиками» из фильтровальной бумаги. В щель каждой пластинки вводят сыворотку крови, предварительно разведенную буферным раствором. На электрофореграмму наносят около 100—300 мкг белка в объеме 0,01 мл. Прибор подключают к источнику тока. Медленно повышая напряжение, доводят силу тока до 20—25 мА (напряжение 200—300 В). Электрофорез проводят в течение 3—4 ч.

Обработка агаровых пластинок. После окончания электрофореза ток выключают, предметные стекла с агаровым гелем тотчас извлекают из камеры и помещают на 30 мин в 5%-ный раствор СНзСООН. Каждую пластинку покрывают листочком фильтровальной бумаги, смоченным в 5%-ном растворе СНзСООН, для удаления воды и солей и высушивают при комнатной температуре в течение ночи. Для ускорения высушивания его проводят при температуре 37 °С или под струей теплого воздуха. Бумагу, приставшую к агаровой пленке, осторожно снимают, предварительно смочив ее водой. Перед окрашиванием агаровое поле должно быть совершенно сухим и прозрачным. Окрашивание белков на электрофореграммах проводят амидовым черным 10 Б в течение ночи. Не связавшийся с белком краситель отмывают 5%-ным раствором уксусной кислоты. Отмытые электрофореграммы высушивают при 37 °С.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИ

страница 47
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы 1с бухгалтерия 8.3 бухучет вднх
цены на циркуляционный насос
курсы дизаинеры квартира
курсы менеджмента и управления по продажам

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)