химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

л реактива Фолина—Чокальтеу и после тщательного перемешивания к смеси добавляют 2,0 мл хлороформа для удаления следов изоамилового спирта. Все тщательно перемешивают, затем хлороформ удаляют после центрифугирования 15 мин при 2000 g. Окраска развивается в течение 30 мин, после чего раствор колориметрируют при 750 нм. При построении калибровочного графика в стандартные пробы добавляют те же компоненты, что и в опытные.

ЛИТЕРАТУРА

1. Mather J Н., Тamр 1 i п С. В. A method for the determination of protein in the presence of Triton X—100//Anal. Biochem. 1979. Vol. 93, N 1. P. 139.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ С КУМАССИ СИНИМ

Метод основан на связывании с белками одного из кислых красителей кумасси синего, выпускаемого в двух модификациях: #-250 и G-250. При связывании с белками спектр поглощения красителя меняется; интенсивности окраски от концентрации белка в пробе и диапазоне 1—10 мкг/мл имеет линейную зависимость.

Многие из исследованных соединений (фосфат, цитрат, пирофос-фат, ацетат, HEPES, MOPS, MES, BES, PIPES, трис, какодилат, фор-миат, дитиотреитол, ЭГТА, глицин, тирозин, а также аденозин, АТФ, тимидин, ДНК, РНК, полиадениловая кислота) не влияют на развитие окраски. Наличие в среде инкубации амфолинов вызывает значительное увеличение оптической плотности. Поскольку белки различаются по своей способности связывать красители, желательно строить калибровочный график с использованием того белка, концентрацию которого в дальнейшем предполагают определять.

Реактивы:

1. Стандартный раствор белка, содержащий 0,05 мг в 1 мл.

2. Раствор красителя. 10 мг красителя (Coomassie brilliant blue G) гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе в 5 мл 95%-ного спирта. Полученный раствор смешивают с 10 мл 95%-ной фосфорной кислоты, разводят водой до конечного объема 100 мл. Отфильтрованный раствор красителя хранится при комнатной тем; пературе около двух недель.

1,5 мл раствора, содержащего от 10 до 50 мкг белка, смешивают с 1,5 мл раствора красителя. Через 3—5 мин измеряют оптическую плотность при 595 нм, используя в качестве контроля пробу, не содержащую белка. В описанной модификации Л595 линейно зависит от количества белка в интервале от 10 до 50 мкг.

2. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД

Метод основан на способности ароматических аминокислот (триптофана, тирозина и в меньшей степени фенилаланина) поглощать ультрафиолетовый свет с максимумом при 280 нм. Измеряя величину оптической плотности при этой длине волны, находят количество белка в растворе. Поскольку белки отличаются по содержанию ароматических аминокислот, их поглощение в ультрафиолетовой области спектра может сильно различаться. Условно считают, что при концентрации «усредненного» белка в растворе, равной 1 мг/мл, величина оптической плотности при 280 нм равна 1,0 (при толщине слоя жидкости в 1 см).

Определению белка данным методом мешает присутствие нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Измеряя оптическую плотность раствора при 260 нм (для учета поглощения соединений нуклеотидной природы) и 280 нм, содержание белка рассчитывают с помощью номограммы (рис. 6): экспериментально полученные величины оптической плотности при 260 и 280 нм находят в соответствующих столбцах номограммы и соединяют их прямой линией; точка пересечения этой прямой со шкалой, на которой дана концентрация белка, определяет содержание белка в исследуемом растворе.

Содержание белка можно найти по формуле Калькара на основе данных определения оптической плотности при 280 и 260 нм:

Содержание белка= 1,45* Л28о—0,74-Л260 (мг/мл). ~ ^^^i^. xiv^iiri/i осшул О Jl ^llПАРА I AX,

ИММОБИЛИЗОВАННЫХ НА СЕФАРОЗЕ

2,20

2,10

Для определения содержания иммобилизованного белка можно в принципе использовать все известные методы, применяющиеся при работе с растворимыми белками. Однако из-за светорассеяния, характерного для гелей агарозы, быстрого оседания их частиц, а также адсорбции красителей на гелях в определение содержания белка внесены отдельные модификации. Могут быть рекомендованы спектрофотометрический и колориметрический методы.

? 2,00

? 1,90 1,80 2,00

2,00 1,90 1,80/ 1,70 1,60 1,50 1,40 1,30 1,20 1,10

1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10

I 1,90 1,80 1,70 1,60 1,50 1,40 1,30 1,201,10 1,00 -0,90 0,80 0,700,60 0,50

— 0,40 0,30 0,20 0,10 0,00

1,70 , 1,60 1,50 1,40

1,30

1,20 1,10

1,00 0,90 0,80 0,70 0,60 0,50 0,40 0,30 0,20 0,10

0,00

280

260

* °'00 о елок,

т(мл t

Рис. 6. Номограмма для определения белка

СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ В ПРИСУТСТВИИ ПОЛИЭТИЛЕНГЛИКОЛЯ

Внесение раствора полиэтиленгли-коля препятствует оседанию частиц се-фарозы и снижает их светорассеяние. Метод позволяет определять белок в препаратах, содержащих не менее 10 мкг белка на 1 мл осажденного центрифугированием геля.

Реактивы:

1. Полиэтиленгликоль (м.м. = 20 000 Да) — 50%-ный водный раствор.

2. Суспензия сефарозы 4В с иммобилизованным белком.

3 Суспензия неактивированной сефарозы.

4 Стандартный раствор белка — 0,5—2,0 мг в мл.

В спектрофо

страница 42
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
GXT3-10000T230
распродажа участков
комоды продажа в москве
установка приточной машины и обвязка фрионопроводом цена

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.11.2017)