химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

40 нм.

Содержание белка в исследуемых растворах рассчитывают по калибровочному графику (с. 9). Определению мешает присутствие солей аммония.

шикриипрсделение

Реактивы:

1. Стандартный раствор белка, например сывороточного альбумина, содержащий 1 мг в 1 мл.

2. Биуретовый реактив для микроопределения (реактив Бенедикта): 17,3 г цитрата натрия и 10 г Na2C03 растворяют при подогревании в небольшом количестве воды. В раствор добавляют 1,73 г сульфата меди, растворенного в 10 мл воды, и доводят водой до 100 мл.

3. NaOH — 6%-ный раствор.

К 2 мл раствора, содержащего 0,1—2 мг белка, добавляют 2 мл (?%-ного раствора NaOH и 0,2 мл реактива Бенедикта. Раствор хорошо перемешивают и через 15 мин фотометрируют при 330 нм на спектрофотометре. Предварительно строят калибровочный график по стандартному раствору белка.

МЕТОД ЛОУРИ

Метод основан на образовании окрашенных продуктов ароматических аминокислот с реактивом Фолина в сочетании с биуретовой реакцией на пептидные связи. Метод характеризуется высокой чувствительностью (10—100 мкг белка в пробе). На развитие окраски влияет большое количество веществ: компоненты буферных систем (трис-буфер в концентрации 0,2 мМ, глицилглицин), восстановители (цистеин, дити-отреитол в концентрации 0,01—0,4 мМ, аскорбиновая кислота), комп-лексоны (ЭДТА в концентрации 0,5 мМ), детергенты (тритон Х-100 в концентрации 0,1—0,2% вызывает выпадение осадка), сернокислый аммоний в концентрации 0,15%, сахароза в концентрации 10% и др.

В связи с этим при построении калибровочного графика для определения белка по Лоури в растворитель для стандартного белка необходимо включать все компоненты, содержащиеся в анализируемых пробах. В некоторых случаях целесообразно предварительное осаждение белков из растворов, например трихлоруксусной кислотой, с последующим растворением их в щелочных растворах, или очистка белковых растворов от низкомолекулярных компонентов путем диализа или гель-фильтрации на сефадексе G-25.

Реактивы:

1. Стандартный раствор белка, содержащий 0,25 мг в 1 мл.

2. Na2C03 — 2%-ный раствор в 0,1 н. растворе NaOH.

3. CuS04-5H20 — 0,5%-ный раствор в 1%-ном цитрате натрия.

4. Рабочий раствор: 1 мл реактива 3 в день определения смешивают с 50 мл реактива 2.

5. Реактив Фолина—Чокальтеу: 10 г Na2Wo4-2H20 (перекристаллизованный) и 2,5 г Na2Mo04-2H20 помещают в круглодонную колбу на 200—250 мл, приливают 70 мл воды и хорошо перемешивают. К полученному раствору добавляют 5 мл 85%-ного раствора фосфорной кислоты и 10 мл концентрированной НС1 (х. ч.). Колбу присоединяют к обратному холодильнику (на шлифе), ставят на сетку и кипятят в течение 10 ч. Затем в раствор добавляют 15 г Li2S04, 5 мл воды и одну каплю брома. Раствор перемешивают и нагревают для удаления брома. После охлаждения доводят водой до 100 мл, фильтруют и разводят водии с ldftMM расчеши, чтиоы получился 1 н. раствор кислоты (т. е. приблизительно вдвое). Кислотность определяют титрованием разведенного в 10 раз реактива 0,1 н. щелочью в присутствии фенолфталеина. Реактив может храниться в темной склянке длительное время.

6. СС13СООН — 10%-ный раствор.

7. NaOH — 1 н. раствор.

К 0,4 мл исследуемого раствора, содержащего 10—100 мкг белка, приливают 2,0 мл рабочего раствора (4), перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 10 мин. Затем добавляют 0,2 мл реактива Фолина—Чокальтеу, содержимое пробирки тщательно перемешивают и через 30 мин колориметрируют при 750 нм. Содержание белка рассчитывают по калибровочному графику.

В случае предварительного осаждения белка к исследуемому раствору добавляют СОзСООН из такого расчета, чтобы конечная концентрация ее была равна 3—4%. Раствор тщательно перемешивают и оставляют на 10—20 мин. Выпавший осадок белка отделяют центрифугированием и промывают 2%-ным раствором СОзСООН. К осадку добавляют 1—2 мл 1 н. раствора щелочи и осторожно подогревают до растворения осадка белка. Раствор белка количественно переносят в мерную колбу на 25—50 мл, доводят водой до метки, тщательно перемешивают и проводят определение белка.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКД"в ПРИСУТСТВИИ НЕИОННЫХ ДЕТЕРГЕНТОВ

Для солюбилизации мембранных белков часто используют неионные детергенты, такие как тритон Х-100, твин-80 и др. Эти детергенты влияют на развитие окраски при определении белка с биуретовьш реактивом и методом Лоури. Практически полного удаления детергентов из пробы можно добиться экстракцией их изоамиловым спиртом.

Реактивы:

1. Изоамиловый спирт.

2. Хлороформ.

3. Реактивы для определения белка по методу Лоури (с. 81).

0,5 мл раствора белка (10—100 мкг), содержащего тритон Х-100, смешивают с 0,5 мл 1 н. раствора NaOH и 3 мл рабочего раствора (п. 4, с. 81). После 10-минутного выдерживания при комнатной температуре к полученной смеси добавляют 3 мл изоамилового спирта и снова тщательно перемешивают. Смесь центрифугируют 10 мин при 2000 g. Верхний слой, содержащий изоамиловый спирт, осторожно удаляют с помощью шприца. Оставшуюся жидкость (4 мл) помещают в чистую пробирку, прибавляют 0,38 м

страница 41
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
спермограмма сдать анализ
ручка оконная 8мм
найти матрасы интернет магазин размери на 190и длина 200
наклейки на машину с днем пограничника купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(22.11.2017)