химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ованной водой и доводят рН до

1,и н. раствором Nauii или iSSJtt (можно капельным методом с универсальным индикатором, если объем экстракта мал). Выпавший в осадок белок следует отфильтровать.

Схема проведения опыта

Ms-пробы Состгв пробы, мл Время инкубации, мин

буфер MgS04 экстракт глкжозо-1-фосфзт инактивиров ^in-пый экстракт

1 0,4 0,1 0,5 1,0

2 0,4 0,1 — 0,5 1,0 —

3 0,4 0,1 1,0 0,5 —? 30

4 0,4 0,1 1,0 0,5 30

В данной задаче ферментативный процесс прекращают, нагревая пробы в кипящей водяной бане. В связи с этим в пробы 1 и 2 («до инкубации») добавляют инактивированный нагреванием экстракт. Инактивацию проводят следующим образом: наливают в пробирку 3 мл экстракта и помещают в кипящую водяную баню на 5 мин, после чего охлаждают во льду. Пробы 3—4 перед добавлением субстрата преинкубируют в присутствии имидазольного буфера и Mg+2 при комнатной температуре 15 мин для активации фосфоглюкомутазы. В пробы добавляют субстрат и все четыре пробы (1—4) инкубируют 30 мин в водяном термостате при 30°С. По окончании инкубации пробы нагревают в кипящей водяной бане в течение 2 мин и помещают в лед. Во все пробы приливают по 2 мл дистиллированной воды и в случае необходимости фильтруют.

В фильтрате определяют глюкозо-1-фосфат и глюкозо-6-фосфат по фосфату (с. 35). Рассчитывают убыль глюкозо-1-фосфата и прирост глкжозо-6-фосфата в процессе инкубации.

Глюкозо-6-фосфат можно определить также энзиматическим методом в системе, содержащей глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу и НАДФ (с. 40).

ПРЕВРАЩЕНИЕ ГЛКЖОЗО-6-ФОСФАТА ВО ФРУКТОЗО-6-ФОСФАТ

Глюкозофосфатизомераза (КФ 5 3.1.9) катализирует обратимое превращение глюкозо-6-фосфата и фруктозо-6-фосфата. Равновесие устанавливается при соотношении альдозы к кетозе приблизительно равном 2:1. Для проявления активности фермента не требуется присутствия ионов металлов или каких-либо кофакторов. Реакция изомеризации легко протекает в диализованных экстрактах мышц. Отсутствие АТФ в таких экстрактах делает невозможным дальнейшее превращение фруктозо-6-фосфата под влиянием фосфофруктокчназы. О процессе изомеризации судят по изменению содержания глюкозо-6-фосфата и фруктозо-б-фосфата в процессе инкубации.

Приготовление диализованного мышечного экстракта. Все процедуры по извлечению мышц осуществляют на холоде по возможности быстро. Реактивы и посуду предварительно охлаждают на льду. Используют скелетные мышцы крысы и кролика или грудную мышцу — у голубя. Взвешивают 3 г мышечной кашицы (приготовление см. на с 49) и гомогенизируют с пятикратным объемом холодного 0,5%-ного раствора КС1 в течение 2 мин. Гомогенат центрифугируют в центрифу

ас с иллиждением iu мин при IZUUU g. падосадочную жидкость помещают в целлофановый мешочек или диализную трубку (рис. 5) и проводят диализ против 0,5%-ного раствора K.CI в стакане на 1—2 л в холодной комнате в течение 5—6 ч. Для ускорения диализа рекомендуется несколько раз (3—4) менять раствор КС1 в стакане и перемешивать его магнитной мешалкой. В случае необходимости диализ можно продлить до 24 ч. После диализа экстракт хранят в холодильнике при 4° С. Фермент сохраняет активность в течение неРнс 5. Простейший диализатор

дели. Непосредственно перед опытом экстракт разводят холодным ?,5%-ным раствором КС1 в 15—20 раз.

Реактивы:

1. Глициновый буфер— 1,5-10"1 М раствор, рН 9,0.

2. Глюкозо-6-фосфат —3-10~2М раствор.

3. КС1 — 0,5%-ный раствор.

4. NaOH — 0,4 н. раствор.

5. СС13СООН —5%-ный раствор или 0,5 н. раствор НСЮ4.

6. Реактивы для определения фруктозо-6-фосфата с резорцином (с. 49).

7. Реактивы для определения фосфата (с. 34).

Перед началом работы нужное количество экстракта разводят в 15—20 раз 0,5%-ным раствором КС1. Выпавший осадок денатурировавших белков можно отфильтровать.

Схема проведения опыта

№ пробы Состав проб, мл Время иркубрции, мин

глюкозо-6-фосфчт глициновый буфер экстракт тк^ии

1,2 0,5 1,0 1,50

3,4 0,5 1,0 1,50 10

5,6 0,5 1,0 1,50 20

7,8 0,5 1,0 1,50 30

В пробы 1 и 2 (пробы «до инкубации») перед добавлением экстракта приливают по 3 мл 5%-ного раствора СС13СООН. Остальные пробы после добавления экстракта инкубируют в водяном термостате при 26°С. По окончании инкубации в пробы 3—8 добавляют по 3 мл 5%-ного раствора СС13СООН. В безбелковом фильтрате фруктозо-6-фосфат определяют по фруктозе (с. 41), глюкозо-6-фосфат и фрукто-зо-6-фосфат определяют вместе, по нарастанию фосфата после щелочного гидролиза (с. 40). Трихлоруксусный фильтрат перед проведением

Щелочного гидролиза необходимо нейтрализовать. Учитывая количество найденного фруктозо-6-фосфата, рассчитывают содержание глюко-зо-6-фосфата в пробах. По убыли глюкозо-б-фосфата рассчитывают процент его изомеризации.

Убыль глюкозо-6-фосфата можно определить и энзиматическим методом, как описано на с. 40. В этом случае белки осаждают хлорной кислотой. Хлорную кислоту удаляют в виде перхлората калия • (с. 29).

ПРЕВРАЩЕНИЕ ФРУКТОЗО-6-ФОСФАТА В ГЛЮКОЗО 6-ФОСФАТ

Работы выполняют согласно методике, описанной на

страница 31
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
дверные ручки малетти фабрики лорд
купить табличку выгул собак запрещен
антенна для волейбольной сетки
заказать линзы на год с диоптриями

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(20.08.2017)