химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

олиза судят по убыли субстрата и по приросту конечного продукта гликолиза — молочной кислоты. В качестве субстрата гликолиза может быть использован фруктозо-1,6-ди фосфат. Обычно работают с мышечной тканью.

Реактивы:

1. Калий-фосфатный буфер — 0,05 М раствор, рН 7,4.

2. Фруктозо-1,б-дифосфат (натриевая соль) — 40 мМ раствор, рН 7,4.

3. MgCl2-6H20 —0,016 М раствор.

4. Хлорная кислота — 0,5 н. раствор.

5. КОН — 5 н. раствор.

6. Реактивы для определения фруктозо-1,6-дифосфата с резорцином (с. 42).

7. Реактивы для определения молочной кислоты с л-оксидифени-лом (с. 27) или энзиматическим методом (с. 28).

Используют экстракт мышц, содержащий митохондрии, полученный из 5 г измельченных мышц (с. 50). Для опыта готовят 6 колбочек емкостью 25—30 мл, плотно закрывают резиновыми пробками. В каждую пробку вставлены по две стеклянные трубочки, одна из которых длинная, доходящая почти до дна, другая — короткая, оканчивающаяся сразу под пробкой. Через длинную трубочку газ входит в колбочку, через короткую выходит из нее. Таким образом, с помощью такой системы воздух в колбочках может быть заменен кислородом, азотом или аргоном (рис. 4). Вместо колбочек можно использовать пробирки с такой же системой для пропускания газов. Перед заполнением реакционной смесью все колбочки ставят в лед. В пробы 1 и 2 (пробы «до инкубации») приливают по 4 мл хлорной кислоты перед добавлением экстракта. В пробы 3—6 вносят фруктозо-1,6-дифосфат и MgCl2, закрывают пробками с трубочками. Через пробы 3 и 4 в течение 10 мин пропускают кислород, через пробы 5 и 6 — азот. В пробы 3—6 доРис. 4. Колбочка для смены газовой фазы

Схема проведения опыта

№ пробы Состав пробы, мл Время иккубацни, мин

фруктозо 1,6-дифосфат MgCl2 20% ный экстракт мышц газовая среда

1,2 0,5 0,5 3,0 воздух

3,4 0,5 0,5 3,0 о2 20

5,6 0,5 0,5 3,0 N2 (или Аг) 20

бавляют по 3 мл экстракта мышц и продолжают пропускать Ог и N2 соответственно еще в течение 3—5 мин.

ирооки с системой труоочек быстро заменяют на обычные. Ставят все пробы в термостат при 26° С и 20 мин инкубируют при встряхивании. После инкубации пробы помещают в лед и в каждую добавляют по 4 мл хлорной кислоты. Выпавшие в осадок белки удаляют фильтрованием и в фильтрате определяют фруктозо-1,6-дифосфат и молочную кислоту.

При определении молочной кислоты энзиматическим методом безбелковый фильтрат нейтрализуют 5 н. раствором КОН и перхлорат калия удаляют (с. 29). В полученном растворе определяют фруктозоди-фоофат и молочную кислоту.

2. ПРЕВРАЩЕНИЯ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ ПРОДУКТОВ ГЛИКОЛИЗА

ПРЕВРАЩЕНИЕ ГЛЮКОЗО-1-ФОСФАТА В ГЛИКОГЕН

Глюкозо-1-фосфат—промежуточный продукт гликолиза. Его образование в результате фосфоролитического отщепления нередуцирующе-го концевого остатка глюкозы от гликогена катализируется ферментом гликогенфосфор илазой (КФ 2.4.1.1). Реакция обратима:

(CsHio05)n+ Н3Р04^ (С6Ню05) п-1 + глюкозо-1 -фосфат.

Фосфорилаза мышечной ткани существует в двух взанмопревра-щающихся формах: активной — фосфорилаза а и неактивной — фосфорилаза Ъ (с. 219).

В задаче предлагается проследить за превращением глюкозо-1-фосфата из скелетных и сердечной мышц крысы (кролика) в гликоген, измеряя количество неорганического фосфата, образующегося в процессе инкубации при участии фоофорилазы (обратная реакция). Добавление в реакционную смесь АМФ позволяет определить убыль глю-козо-1-фосфата под влиянием обеих форм фосфорилазы. В пробах без АМФ ферментативное превращение глюкозо-1-фосфата будет осуществляться только фосфорилазой а. По разности между приростом неорганического фосфата, освобождающегося в ходе реакции в присутствии и отсутствие АМФ, рассчитывают убыль глюкозо-1-фосфата в результате действия фосфорилазы Ь. Следует учесть, что фосфорилаза а в реакционной среде без АМФ проявляет только 70% активности, определяемой в его присутствии. В связи с этим при расчете убыли глюко-зо-1-фоофата в пробе с АМФ под влиянием фосфорилазы Ь необходимо величину, полученную для фосфорилазы а в пробе без АМФ, пересчитать на 100%.

Получение тканевого экстракта. Только что выделенные из организма (с. 49) скелетные мышцы и сердце помещают в стакан с ледяной средой гомогенизации (раствор № 1). Сердце отмывают от крови. 1—2 г измельченной ткани используют для приготовления гомогената, а затем экстракта, не содержащего митохондрий (с. 50).

Реактивы:

1. ЭДТА — 5-Ю"1 М раствор, рН 7,4, содержащий NaF МО"1 М (раствор № 1).

2. ЭДТА — 5-10-1 М раствор, рН 6,1, содержащий NaF Ы0-1 М (раствор № 2).

3. Гликоген — 2%-ный раствор, приготовлен на растворе № 2.

4. Глюкозо-1-фосфат — 1,2-10"1 М, приготовлен на растворе № 2.

5. АМФ—1-10~2М раствор, приготовлен на растворе № 2.

т 6. Трихлоруксусная кислота — 5%-ный раствор.

7. Реактивы для определения неорганического фосфата (по методу Херса, см. с. 35).

Непосредственно перед опытом экстракт скелетных мышц раствором № 2 дополнительно разводят в 20 раз. Экстракт из мышцы сердца разводят только в 3 раза. Заполняют пробы, стоящие во льду

страница 29
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
фундаментные блоки 5 цена
наружная реклама виды и формы
nema1-m3 для fc-051 2.2-7.5 квт 132b0105
мебель ру

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(22.09.2017)