химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

Orthophosphate//Anal. Biochem. 1983, Vol. 132.

III. ФЕРМЕНТАТИВНЫЕ ПРЕВРАЩЕНИЯ УГЛЕВОДОВ

Для выполнения работ, представленных в данном разделе, используют общие приемы, необходимые при проведении биохимического эксперимента.

Работу начинают с подготовки ряда проб, содержащих субстраты и кофакторы реакции в буферной среде определенного состава. Перед добавлением ферментативного препарата все пробы для охлаждения помещают в лед. В каждом эксперименте обязательно присутствуют

контрольные пробы (пробы «до инкубации»), предназначенные для определения исходного содержания субстратов и продуктов реакции,, их не инкубируют. Остальные пробы после добавления ферментативного препарата перемешивают и ставят на инкубацию в условиях, указанных в каждой конкретной методике. После инкубации пробы снова помещают в лед, к реакционной смеси добавляют трихлоруксусную-или хлорную кислоту до конечной концентрации 2,5%, перемешивают и оставляют на холоде. Через 10 мин осадок денатурированного белка удаляют фильтрованием или центрифугированием. Если закисление реакционной среды нежелательно, ферментативную реакцию останавливают, нагревая пробы в кипящей водяной бане. В полученных безбел-*ковых растворах определяют содержание субстратов и продуктов реакции. Предварительно рассчитывают их примерное возможное количество в каждой пробе. При расчете можно принять, что в пробах, полученных в оптимальных условиях для данной реакции, в процессе инкубации происходит превращение субстрата на 50%. Учитывая возможное содержание исследуемого вещества в пробе, берут несколько аликвот для определения. При необходимости безбелковый раствор разводят дистиллированной водой. Рассчитывают убыль субстрата к прирост продуктов реакции в микромолях на пробу с учетом всех разведений. Результаты оформляют в виде таблицы или графика.

1. АНАЭРОБНЫЙ РАСПАД УГЛЕВОДОВ

Ферментативный анаэробный распад углеводов исследуют при инкубации тканевого гомогената или экстракта с субстратами гликолиза (гликогеном, глюкозой, а также с промежуточными продуктами гликолиза). О процессе судят по приросту конечного продукта анаэробного превращения углеводов — лактата или убыли субстратов. Отдельные этапы изучают при добавлении в инкубационную среду ингибиторов ферментов или удалении диализом кофакторов и коферментов, необходимых для определенных реакций процесса анаэробного превращения углеводов.

Работу проводят с экстрактами мышц, не содержащими митохондрий. При постановке опытов с гомогенатами, а также с экстрактами, содержащими митохондрии, тканевое дыхание выключают цианидом (конечная концентрация цианида—10~3 М) или проводят инкубацию в анаэробных условиях, в атмосфере азота или аргона.

Получение гомогената скелетных мышц крысы. Среда выделения: калий-фосфатный буфер —0,05 М раствор, рН 7,6; рН буфера проверяют на потенциометре или с универсальным индикатором буферным методом. Всю посуду перед работой необходимо охладить на льду.

Мышцы спины и задних конечностей декапитированной крысы помещают в стакан с охлажденной средой выделения. Через 10 мин их вынимают по одной на чашку Петри, обсушивают фильтровальной бумагой, очищают от жира и соединительной ткани и тщательно измельчают ножницами в кашицу. Навеску этой массы (3—5 г) берут на технохимических весах в фарфоровой чашке, предварительно взвешенной и стоящей во льду, и делят ее на 2—3 части для порционного гомогенизирования. Порцию кашицы переносят в охлажденный стеклянный стакан гомогенизатора Поттера с тефлоновым пестиком, добавляют 5 объемов среды выделения (на 1 г ткани 5 мл), перемешивают стеклянной палочкой и гомогенизируют 1—2 мин. Гомогенат сливают в стакан. Процедуру повторяют со следующими порциями; гомогенаты объединяют.

Для выполнения некоторых работ гомогенизацию заменяют растиранием мышечной кашицы в ступке с кварцевым песком и с 2— 3 объемами среды выделения в течение 30 мин. При такой грубой обработке митохондрии разрушаются, однако окислительные процессы и даже окислительное фосфорилирование могут идти за счет обломков митохондрий. К растертой ткани добавляют среду выделения с таким расчетом, чтобы получить 20%-ный гомогенат: 1 мл гомогената должен содержать 200 мг ткани (разведение 1:5).

Получение экстракта, содержащего митохондрии. Гомогенат мышц центрифугируют в течение 10 мин при 600 g и температуре 4°С для удаления обломков Клеток и ядер. Надосадочную жидкость (экстракт мышц) фильтруют через четыре слоя влажной марли. Экстракт содержит гликолитические ферменты, митохондрии и микросомы. Измеряют рН и доводят его до значения 7,4. До опыта экстракт хранят при низкой температуре. Получение гомогената и экстракта рекомендуется проводить в холодной комнате и использовать в день получения, чтобы сохранить достаточно высокую активность митохондрий.

Получение экстракта, не содержащего митохондрий. Гомогенат мышц центрифугируют 10 мин при 12 000^—15 000и температуре 4°С. Надосадочную жидкость, представляющую собой экстракт мышц, свободный от митохондрий, ядер и обломков клеток, фил

страница 25
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
ремонт холодильника самсунг rl 38
реклама компании
решетки сезон вр-пкм
психолог для справки в гибдд в крылатском

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(22.09.2017)