химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

азные реакции в мышечных клетках//Тру-ды V Междунар. биохим. конгр. Симп. 2. М., 1962. С. 286.

2. Слейтер Е. С. Механизм разобщения окислительного фосфорилирования нитро-фенолами//Труды V Междунар. биохим. конгр. Симп. 5. М., 1962. С. 343.

3. А к и м е н к о В. К. Белковые сонрягающие факторы окислительного фосфорилиро-вания//Митохондрии. Регуляция процессов окисления и сопряжения. М., 1974, С. 26.

6. ИЗУЧЕНИЕ АТФАЗНОЙ РЕАКЦИИ, КАТАЛИЗИРУЕМОЙ АТФ-СИНТЕТАЗНЫМ КОМПЛЕКСОМ МИТОХОНДРИЙ

Реакции* синтеза и гидролиза АТФ катализируются АТФ-синтетаз-ным комплексом, локализованным во внутренней мембране митохондрий. Обе реакции сопряжены с трансмембранным переносом Н+. Н+—АТФаза митохондрий сердца быка состоит из фактора F{ и мембранного компонента Fo. Фактор Fx может быть отделен от мембраны и катализировать гидролиз АТФ в растворе. Реакция синтеза АТФ, сопряженная с трансмембранным переносом Н+, протекает только в том случае, когда фактор F\ связан с мембраной. Мембранный компонент АТФ-синтетазного комплекса образует «протонный канал», обеспечивая транспорт №~ с внешней стороны митохондриальной мембраны к фактору F\, где находится активный центр фермента.

Известно, что субстратами для реакции гидролиза являются не только АТФ, но и другие нуклеозидтрифосфаты (НТФ). Скорость НТФазной реакции убывает в следующем порядке: АТФ>ИТФ>ГТФ> УТФ>ЦТФ. Не ясно, различаются ли между собой механизмы гидролиза АТФ и других НТФ.

Для протекания гидролазной реакции необходимы ионы двухвалентных металлов (Ме2+), в частности Mg2+, но специфичность по металлу не является абсолютной.

Важным фактором, оказывающим влияние на гидролазную активность, является АДФ — продукт АТФазной и субстрат АТФ-синтетаз-ной реакции. В определенных концентрациях АДФ ингибирует гидролиз АТФ по простому конкурентному типу торможения. Действие АДФ очень специфично. Только АДФ является ингибитором гидролиза АТФ и других НТФ. Известны активаторы АТФазы, действие которых обусловлено снятием торможения, вызванного АДФ. К таким активаторам относится, например, сульфит-ион.

Цель данной задачи — изучение АТФазной и ИТФазной активности СМЧ, выделенных из митохондрий сердца быка, а также сравнение действия АДФ, ИДФ и сульфит-иона на гидролиз этих НТФ.

Реактивы и оборудование:

1. Среда инкубации, содержащая 0,1 М КС!, 5 мМ трис-HCl (рН 8,0), 50 мкМ ЭДТА и 2 мМ MgCl2.

2. АДФ — 25 мМ раствор (рН 8,0).

А -7 Л

3. KHS03 — 0,5 M раствор.

4. Олигомицин — раствор 1 мг/мл (в перегнанном этаноле).

5. Mg—АТФ и Mg—ИТФ — 0,1 М растворы, рН 8,0.

6. Регистрирующий рН-метр с набором кювет и микропипеток.

Примечание. Растворы Mg—АТФ и Mg—ИТФ готовят растворением рассчитанной навески АТФ и ИТФ в небольшом объеме, доводят рН до нейтрального. Затем добавляют необходимый объем концентрированного раствора MgCl2, после чего смесь доводят до нужного объема. '

Изучение АТФазной активности СМЧ. В качестве объекта исследования используют субмитохондриальные частицы, полученные из митохондрий сердца быка (см. с. 408).

АТФазную активность регистрируют рН-метрическим методом, который основан на том, что гидролиз АТФ при значениях рН, близких к нейтральным, приводит к появлению в среде ионов Н+ из-за различий в рК диссоциирующих групп субстрата (АТФ) и продуктов реакции (АДФ и Фн):

АТФ + Н2Оч^АДФ + Фн + яН+,

где п изменяется от 0 до 1 при изменении рН от 6,2 до 9,0-. При рН 8,0 стехиометрия Н+/АДФ составляет 0,9.

Измерение АТФазной активности проводят в кювете объемом 5 мл при комнатной температуре в среде следующего состава — 0,1 М КС1, 50 мкМ ЭДТА, 2 мМ MgCl2, 5 мМ трис-HCl (рН 8,0). В кювету перед измерением добавляют раствор Mg—АТФ до необходимой конечной концентрации. Линейность зависимости показания прибора от количества Н+-ионов проверяют, добавляя в среду измерения небольшие порции раствора НС1 известной концентрации. Реакцию начинают добавлением СМЧ в количестве примерно 0,5 мг на пробу. При добавлении СМЧ измеряется АТФазная активность, а начальная скорость реакции не связана с неспецифическим ответом электрода на добавку. Чтобы проверить это, реакцию можно начать неактивным ферментом, например олигомицином — специфическим ингибитором АТФазы, действующим на Н+-канал необратимо. К порции СМФ добавляют олигомицин в стехиометрических количествах (из расчета 0,8 мкг олигомицина на 1 мг белка). После 5—10-минутной инкубации такие СМЧ добавляют в среду измерения активности и наблюдают неспецифическую реакцию электрода на эту добавку. Так как в ходе гидролиза уменьшается концентрация АТФ и накапливается ингибитор АДФ, скорость реакции падает. За истинную скорость принимают начальную скорость, которую определяют, проведя касательную к точке начала реакции или через несколько секунд после начала.

Изучение действия АДФ, ИДФ и сульфит-иона на АТФазную и ИТФазную активность СМЧ. При выполнении задачи гидролазные активности измеряют как указано выше в следующих условиях:

1) среда измерения содержит только Mg—АТФ или Mg—ИТФ в конечных концентрациях 1

страница 245
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
кресло 9908
металлические банкетки скамейки

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(29.04.2017)