химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

кислородом. Механизмом, обеспечивающим сопряжение этих двух реакций, является АТФ-синтетазный комплекс, способный в определенных условиях катализировать гидролитический распад АТФ. Последняя реакция (АТФазная активность) служит удобным объектом для изучения механизма окислительного фосфорилирования. Схема, иллюстрирующая процесс образования и распада АТФ в митохондриях, приведена на рис. 60.

Химический механизм сопряжения переноса электронов с образованием АТФ неизвестен. Наибольшее признание в последние годы получила гипотеза П. Митчелла об электрохимическом (хемиосмотиче-ском) сопряжении окислительных реакций в дыхательной цепи с синтезом АТФ, катализируемым АТФ-синтетазным комплексом. Согласно этой гипотезе вне- и внутримитохондриальные пространства (левая и правая часть рисунка соответственно) разделены мембраной М, непроницаемой для ионов водорода — Н+. Дыхательная цепь организована в мембране таким образом, что окисление субстрата (SH2) кислородом приводит к разделению зарядов (группа реакций — I). Энергия окисления запасается в виде электрохимического потенциала Н+

?ирапш, ивииидная энергия складывается и?

АДФ + Фн

собственно электрической компоненты (разделение зарядов: Н+ — слева, ОН — справа) и концентрационного градиента (разница рН внутри и вне митохондрий). АТФ-синтетазный комплекс (на схеме

Рис. 60. Схематическое изображение процессов синтеза и гидролиза АТФ в митохондриях

заштриховано) обеспечивает экзэргоническое перемещение Н+ слева направо и образование за счет освобождающейся энергии АТФ из АДФ и Фн (группа реакций II). Неспецифический перенос протонов через мембрану слева направо анионом U~ освобождает энергию в виде тепла и разобщает окисление и фосфорилирование. Гидролиз АТФ приводит к переносу двух Н+ справа налево и возникновению электрохимического потенциала. Таким образом, АТФазная активность интактных митохондрий мала до тех пор, пока отсутствуют пути переноса Н+ слева направо. Добавление разобщителей снимает электрохимический потенциал Н+ и резко стимулирует АТФазную активность (комбинация реакций II и III). Функционирование АТФ-синтетазного (или АТФ-аз-ного) комплекса требует присутствия ионов Mg2+. В интактных митохондриях их концентрация обычно достаточно велика, чтобы обеспечить высокую скорость гидролиза АТФ в присутствии разобщителя. Разрушение митохондриальной Мембраны (детергентами, ультразвуком, нагреванием) обычно приводит к появлению неспецифической проводимости мембраны для Н+ или полному снятию барьера М. В этих случаях АТФазная активность сильно активируется и требует для своего проявления добавления ионов Mg2+.

Реактивы:

1. Реактивы для выделения митохондрий (с. 403).

2. КС1 — 0,1 М раствор в 0,05 М трис-HCl (рН 7,4), готовят в день опыта.

3. КС1 — 0,3 М раствор в 0,015 М трис-HCl (рН 7,4), готовят в день опыта.

4. АТФ — 0,025 М раствор, рН 7,4.

5. MgCl2 — растворы следующих концентраций: 0,005; 0,010; 0,025; 0,050; 0,075 и 0,100 М, готовят разведением 0,1 М раствора MgCb, устанавливая концентрацию титрованием с эрио-хромом черным Т (с. 484).

6. 2,4-динитрофенол — 4-10-4 М раствор, рН 7,4.

7. ЭДТА — 0,1 М раствор, рН 7,4.

8. Хлорная кислота — 1 М раствор.

9. Бычий сывороточный альбумин (для митохондрий скелетных мышц — 1%-ный раствор.

10. Реактивы для определения фосфата (с. 34).

Перед выделением митохондрий в 11 колбочках составляют среды инкубации следующего состава, мл:

проб Раствор № 3, мл MgCla. М (ПО

0,2 мл раствора) ДНФ ЭДТА Альбумин* 1%-ный pjcTBop НгО**, мл

1 0,6 0,005 0,2 0,4

2 0,6 0,010 — — 0,2 0,4

3 0,6 0,025 — — 0,2 0,4

4 0,6 0,050 — — 0,2 0,4

5 0,6 0,075 — — 0,2 0,4

6 0,6 0,100 — — 0,2 0,4

7 0,6 — — — 0,2 0,6

8 0,6 — 0,2 — 0,2 0,4

9 0,6 0,025 0,2 .— 0,2 0,2

10 0,6 0,025 0,2 0,2 0,2 —

11 0,6 0,050 0,2 0,2 0,2

* Альбумин используют только в опытах с митохондриями скелетных мышц.

** В случае митохондрий печени воды в каждую пробу добавляют на 0,2 мл больше.

Выделяют митохондрии. Полученный осадок ополаскивают раствором № 2 и суспендируют в той же среде. Для этого к осадку митохондрий, полученному из 10 г мышц, добавляют 1 мл раствора №2, суспендируют, отбирают 0,1 мл на определение белка, оставшийся объем доводят той же средой до 12 мл. При работе с печенью осадок митохондрий суспендируют в 4 мл среды № 2.

В пробу № 11 добавляют 1 мл 1 М НСЮ4, затем во все колбы вносят по 0,2 мл суспензии митохондрий, помещают пробу № 11 в лед, остальные закрепляют в штативе и инкубируют в термостате аппарата Варбурга 15 мин при температуре 26° С. После окончания инкубации во все пробы добавляют по 1 мл 1 М НСЮ4, колбы помещают в лед и

через 15 мин фильтруют. Для определения неорганического фосфата отбирают по 1 мл фильтрата.

Рассчитывают во всех пробах АТФазную активность в микромолях фосфата неорганического Фн за 1 мин на 1 мг белка. Строят график зависимости скорости реакции от концентрации магния в присутствии ДНФ и без него.

ЛИТЕРАТУРА

1. Аццоне Дж. Ф. Аденозинтрифосфат

страница 244
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
установка камеры заднего вида на автомобиль цена в спб
Компания Ренессанс: ступени из березы купить - качественно и быстро!
роби виллиамс в спб концерт
аренда стальных скамеек

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.05.2017)