химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

сидазную активность митохондрий. В кювету полярографа с 2 мл среды с 5 мкМ ротеноном после погружения в нее электродов и включения самописца добавляют 40—60 мкл суспензии митохондрий (4— 5 мг белка). Через 1—2 мин в кювету добавляют 5 мМ сукцинат и регистрируют дыхание митохондрий с постоянной скоростью на протяжении 1—2 мин. Добавляют 5 мкМ ДНФ и регистрируют дыхание до полного исчерпания кислорода в среде. В следующих пробах последовательно увеличивают концентрацию ДНФ до тех пор, пока дальнейшее увеличение ее не будет вызывать увеличения скорости дыхания. В прочносопряженных митохондриях насыщение сукцинатоксидазной активности обычно достигается в присутствии 50—100 мкМ ДНФ. Строят графическую зависимость скорости окисления сукцината в митохондриях от концентрации ДНФ (5—6 экспериментальных точек).

Для проведения следующей части работы на полярографе подбирают максимальную концентрацию Са2+, добавление которого к митохондриям в среде с сукцинатом вызывает обратимую активацию дыхания. Для прочносопряженных митохондрий печени крысы (4—5 мг белка в пробе) это составляет около 200—400 мкМ Са2+. Дальнейшие измерения проводят на регистрирующем рН-метре. В ячейку рН-метра со средой инкубации и погруженными электродами добавляют последовательно митохондрии, сукцинат и выбранную концентрацию Са2+. Регистрируют быстрое освобождение ионов Н+ (закисление среды) из матрикса в ответ на добавление Са2+. После аккумуляции всего добавленного Са2+ изменения рН среды прекратятся и на фоне нового стационарного значения рН в суспензии добавляют 1—2 раза одинаковое количество титрованной НС! или КОН для калибровки шкалы (конечная концентрация НС1 или КОН в используемых условиях должна составлять около Ю-4 М). Проводят серию аналогичных проб, содержащих увеличивающиеся концентрации ДНФ, и каждый раз регистрируют скорость закисления среды в процессе активного транспорта Са2+. Для полного торможения транспорта Са2+ в митохондриях диапазон концентрации ДНФ должен быть значительно (в 2—3 раза) расширен по сравнению с опытами по измерению сукцинатоксидазной активности. Делают 5—6 измерений и строят графическую зависимость скорости транспорта Са2+ от концентрации разобщителя (5—6 экспериментальных точек).

Аналогичным образом измеряют окислительное фосфорилирование по защелачиванию среды в соответствии с уравнением: АДФ3~ + + НР042_+Н+^ьАТФ4_+Н20. Готовят серию проб с увеличивающимися концентрациями разобщителя и убеждаются в постепенном (от пробы к пробе) снижении скорости окислительного фосфорилирования. В этом случае диапазон концентраций разобщителя будет совпадать с диапазоном, найденным ранее при титровании сукцинатоксидазной активности. Каждое измерение должно заканчиваться добавлением титрованной НС1 или КОН для калибровки шкалы. Строят графически зависимость скорости окислительного фосфорилирования от концентрации ДНФ. Анализируют результаты проведенных полярографических и рН-метрических измерений.

ДЛЯ оолее у!луилсншли v-amui-iuniwiuiiun, ~ x

предлагается выполнить следующие работы.

1. Провести измерения трансмембранного потенциала при добавлении в суспензию энергизованных митохондрий увеличивающихся концентраций ДНФ, АДФ и Са2+. Результаты такого титрования сопоставить с результатами основной части работы.

2. Провести отдельные рН-метрические измерения окислительного «фосфорилирования, активного транспорта Са2+ и транспорта Са2+ на ?фоне фосфорилирования АДФ в митохондриях. Рассчитать полученные данные и убедиться в том, что окислительное фосфорилирование не влияет на скорость активного транспорта Са2+, а добавление Са24~ полностью блокирует окислительное фосфорилирование.

3. Провести кинетический анализ ингибирующего действия ДНФ на процессы активного транспорта Са2+ и окислительного фосфорилирования АДФ в митохондриях. Измерения следует провести отдельно для 3 различных концентраций Са2+ и АДФ. Полученные результаты проанализировать в координатах Диксона (t>oM °т концентрации ДНФ.

ЛИТЕРАТУРА

1. Rossi С. S., Lehninger A. L. Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca2+ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria//.!. Biol. Chem. 1964. Vol. 239. P. 3971.

2. Лейкин Ю. H., Барская H. В., Виноградов А. Д. Митохондрии. Аккумуляция энергии и регуляция ферментативных процессов, М., 1977. С. 100.

3. Robertson S. P., Potter G. D., Rouslin W. The Ca2+ and Mg2+ dependence of Ca2+ uptake and respiratory function of porcine heart mitochondria. Probable physiological significance during the cardiac contraction—relaxation cyde//J. Biol. Chem. 1982. Vol. 257. P. 1743.

4. Николе Д. Дж. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию. М, 1985.

5. ИЗМЕРЕНИЕ АТФАЗНОЙ АКТИВНОСТИ МИТОХОНДРИЙ

Перенос электронов по дыхательной цепи митохондрий приводит к аккумуляции энергии окислительно-восстановительных реакций в виде АТФ. Протекание эндергонической реакции синтеза АТФ из АДФ и -Фн (~10 ккал/мол) возможно за счет экзергонической реакции окисления НАДН или сукцината

страница 243
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
очаг fobos bl
bluevision h4
табличка здравпункт
Кувшин Pearl

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.01.2017)