химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

вят на бидистиллированной воде.

Выделяют митохондрии (с. 404). В кювету полярографа помещают 2 мл среды инкубации, погружают электроды и устанавливают положение пера самописца в исходное положение шкалы. Реакцию начинают добавлением 0,04—0,06 мл густой суспензии митохондрий (5—7 г белка). Через 30—40 с в кювету добавляют субстрат окисления (конечные концентрации для сукцината — 10 мМ, для глутамата и малата — по 5 мМ, для аскорбата — 5 мМ, для ТМФД — 100 мкМ). Регистрируют постоянную скорость дыхания и через 40—60 с добавляют 200 мкМ АДФ. После последовательного изменения скоростей дыхания (переход VV-vVV-^VV^1*) через 1—2 мин добавляют 100 мкМ 2,4-динитрофенол. Регистрируют убыль кислорода в кювете до наступления анаэробиоза. Рассчитывают скорости потребления кислорода в различных состояниях, коэффициенты дыхательного контроля и фосфорилирования, скорость фосфорилирования, отношение скоростей

У45/1/4АТФ

Результаты оформляют в виде таблицы.

ЛИТЬРА1*ГЯ

1. Chance В., Williams G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilisation//.!. Biol. Chem. 1955 Vol. 217. P 383.

2. ИЗМЕРЕНИЕ СТЕПЕНИ СОПРЯЖЕННОСТИ И СКОРОСТИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ. ЗАВИСИМОСТЬ ОТ КОНЦЕНТРАЦИИ БЕЛКА И РОЛЬ ИОНОВ Са2+

Изучение большого числа протекающих в митохондриях процессов может быть успешно проведено как с изолированными органеллами в качестве источника фермента, так и с высокоочищенными препаратами соответствующих митохондриальных ферментов. Однако второй подход практически неприемлем для изучения реакций, непосредственно сопряженных с функционированием системы трансформации энергии в митохондриях. В первую очередь это относится к процессу окислительного фосфорилирования, который с высокой эффективностью протекает и может быть изучен либо в изолированных (интактных) митохондриях, либо в специальным образом полученных препаратах субми-тохондриальных частиц. В этом случае также важно убедиться в том, что скорость изучаемой реакции линейно зависит от концентрации катализатора (от концентрации общего белка митохондрий или субми-тохондриальных частиц). Измерение скорости окислительного фосфорилирования и термодинамической эффективности (отношение АДФ/О) традиционно проводится и предшествует изучению любых митохондриальных функций.

В настоящей работе предлагается изучить зависимость скорости окислительного фосфорилирования и степени сопряженности митохондрий печени крысы от концентрации белка и проанализировать причины ее отклонения от линейности.

Реактивы и оборудование:

1. Реактивы для выделения митохондрий печени крысы (с. 406).

2. Среда инкубации, содержащая 0,15 М сахарозу, 75 мМ КС1, 2,5 мМ MgCl2, 5 мМ КН2Р04, рН 7,4 — 50 мл.

3. Сукцинат калия 1 М раствор, рН 7,4.

4. 2,4-динитрофенол — 10 ~2 М раствор, рН 7,4.

5. АДФ — 2-Ю-2 М раствор, рН 7,4.

6. ЭГТА — Ю-2 М раствор, рН 7,4.

7. Ротенон — 5-10~4 М раствор в перегнанном этаноле.

8. Ионофор А23187 — 10~3 М раствор в перегнанном этаноле.

9. СаС1г — 2• 10~2 М раствор, готовят разведением титрованного раствора СаС12 (см. с. 484).

10. НС1 и КОН — Ю-2 М растворы, готовят разведением титрованных растворов НС1 и КОН.

11, Регистрирующий рН-метр или полярограф с набором кювет и

микропипеток (от 10 до 100 мкл).

В первой серии экспериментов подбирают концентрацию разобщителя (ДНФ), вызывающую максимальную стимуляцию дыхания. Для этого промытые и подсушенные электроды полярографа погружают в кювету с 2 мл среды (см. выше), содержащую дополнительно 5 мМ сукцинат и 5 мкМ ротенон. Включают самописец и после установления постоянного по величине тока начинают реакцию добавлением мито_ _ ... ^шлопнс jjciMLipHpywi' Z—<5 МИН И, убеДИВШИСЬ в том, что скорость процесса не изменяется во времени, в кювету добавляют 10 мкМ ДНФ. Убеждаются в активации дыхания, которое регистрируют до исчерпания кислорода в пробе. Стазят аналогичные пробы с возрастающими концентрациями ДНФ (20, 30, 50 и 100 мкМ). Строят графическую зависимость скорости дыхания от концентрации ДНФ и выбирают насыщающую концентрацию разобщителя.

В следующей серии опытов реакцию начинают добавлением различных количеств митохондрий (от 0,5 до 5 мг белка в пробе) и после добавления выбранной концентрации ДНФ каждый раз регистрируют дыхание до исчерпания кислорода в среде.

Проводят аналогичную серию опытов с различными концентрациями белка митохондрий, добавляя вместо разобщителя 200 мкМ АДФ. После превращения всей добавленной АДФ в АТФ и выхода в контролируемое состояние пробы заканчивают (анаэробиоз) добавлением АДФ или ДНФ. Полученные результаты представляют в виде графической зависимости скорости разобщенного дыхания (+ДНФ), скорости дыхания в состоянии 3 ( + АДФ), скорости фосфорилирования, отношения АДФ/О и ДК от концентрации белка митохондрий в пробе.

Проводят три серии экспериментов по измерению окислительного фосфорилирования при различных концентрациях белка митохондрий в среде, содержащей дополнительно 100 мкМ ЭГТА

страница 240
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
кастрюли эмалированные с толстым дном купить германия
удалить вмятины от града в электростали
Барная мебель Пластик купить
сколько стоит курс компьютера

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(08.12.2016)