химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

добавляют в ячейку 0,04—0,05 мл густой суспензии митохондрий (5—6 мг белка). Спустя 1 мин в ячейку добавляют раствор СаС12 в конечной концентрации 3—4-10^ М и регистрируют обратимую стимуляцию дыхания.

Строят график зависимости активированного ионами Са2+ дыхания от рН среды инкубации и анализируют возможные ее причины с учетом влияния рН: а) на активность системы аккумуляции энергии (транспорт субстрата через мембрану, перенос электронов в дыхательной цепи, аппарат сопряжения); б) на активность переносчиков Са24* и неорганического фосфата в мембране; в) на концентрацию истинного субстрата переносчика неорганического фосфата в связи с изменением соотношения различных ионных форм фосфата .

Опыт 2. При двух фиксированных значениях рН (например, 7,1 и 7,8) измеряют зависимость скорости активированного ионами Са2+ дыхания от концентрации в среде фосфата и строят график зависимости в прямых и обратных величинах. Сопоставляя полученные данные (значения Vmax и Km для фосфата) с результатами опыта 1, отвечают на вопрос о том, что является причиной наблюдаемой в опыте 1 зависимости от величины рН.

Рассчитывают концентрации различных ионных форм фосфата при значениях рН, используемых в опыте, и представляют результаты расчетов в виде таблицы. Сравнивают количественно зависимые от рН изменения скорости дыхания в активном состоянии с изменениями концентраций Н3РО4, Н2РО41"", НР042~ и PCV^ и находят, какая из указанных форм фосфата является субстратом переносчика. Оценивают значения Km для выбранной ионной формы фосфата.

ЛИТЕРАТУРА

Виноградов А. Д., Лейкин Ю. Н. Идентификация ионной формы фосфата, сопровождающей активное накопление Са2+митохондриями печени крысы//Биохимия. 1971. Т. 36. С. 1061.

9. РОЛЬ ТРАНСЛОКАЗНЫХ РЕАКЦИЙ В КИНЕТИКЕ СИНТЕЗА И ГИДРОЛИЗА АТФ В МИТОХОНДРИЯХ

Реакция синтеза (или гидролиза) АТФ в митохондриях осуществляется при участии трех ферментных систем: собственно АТФ-синте-тазного комплекса, транслоказы адениннуклеотидов и переносчика неорганического фосфата. Последний катализирует реакцию электронейтрального переноса неорганического фосфата в митохондрии и из них. Активность переносчика ингибируется SH-модификаторами, такими как N-этилмалеимид и n-хлормеркурибензоат. Следствием этого является ингибирование SH-реагентами реакций окислительного фос-форилирования и гидролиза АТФ, катализируемых митохондриями.

В задачу настоящей работы входит изучение роли фосфатного переносчика в функционировании АТФ-гидролазной реакции, катализируемой митохондриями печени крысы. Гидролиз АТФ измеряют в настоящей задаче на рН-метре с регистрирующим самописцем по закис-лению среды в ходе реакции.

Реактивы и оборудование:

1. Реактивы для выделения митохондрий из печени крысы (с. 406).

2. Среда измерения активности, содержащая: 0,15 М сахарозу, 75 мМ КО, 5 мМ фосфат калия, 2,5 мМ MgCl2, 1 мМ АТФ, рН 7,4.

3. 2,4-динитрофенол — 0,01 М раствор, рН 7,4.

4. Тритон Х-100 — 20%-ный раствор.

5. N-этилмалеимид — 10 мМ раствор (готовят в день опыта).

6. Регистрирующий рН-метр с набором кювет и микропиаеток объемом 0,02—0,2 мл.

Выделяют митохондрии из печени крысы. В кювету рН-метра наливают 4,5 мл среды измерения активности (п. 2) и погружают отмытый рН-электрод. Через 2—3 мин в кювету вносят 20—50 мкл суспензии митохондрий (2—4 мг) белка. Убеждаются в том, что нативные митохондрии не катализируют реакцию гидролиза АТФ в отсутствие разобщителя. Через 1 мин после внесения митохондрий в кювету добавляют динитрофенол до конечной концентрации, равной ОД мМ. Внесение разобщителя приводит к снятию трансмембранного электрохимического потенциала ионов водорода и активации реакции гидролиза АТФ. Измерение повторяют, в кювету после добавления митохондрий вместо динитрофенола вносят детергент тритон Х-100 до конечной концентрации 0,1%. Наблюдают, как и в случае динитрофенола, стимуляцию реакции. Выбирают концентрацию тритона (в интервале от 0,02 до 2%) дегя проявления максимальной ферментативной активности.

К 200 мкл густой суспензии митохондрий (~50 мг/мл), стоящей на льду, добавляют N-этилмалеимид до конечной концентрации 0,5 мМ и инкубируют 30 мин. Измеряют АТФазную активность в суспензии, как описано выше. Наблюдают инактивацию ферментативной реакции, измеренной в присутствии динитрофенола, вызванную модификацией фосфатного переносчика. Добавление по ходу реакции тритона Х-100 в оптимальной концентрации, определенной ранее, приводит к снятию барьера проницаемости для фосфата и восстановлению активности.

Примечания, \. При измерении активности на рН-метре необходимо после завершения каждого измерения определять цену деления шкалы на самописце. Для этого в кювету вносят небольшой объем (0,02— 0,05 мл) титрованной щелочи (50 мМ) и фиксируют ответ рН-метра. 2. Все активности выражают в микромолях гидролизованного АТФ за 1 мин в расчете на 1 мг белка митохондрий.

ЛИТЕРАТУРА

1. Fonyo A. SH-Reagent as tools in the study of anion transport//! Bioenerg. and Biomembranes. 1978. Vol. 10. P. 171.

2. W о h

страница 237
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
планшеты напрокат
Рекомендуем компанию Ренесанс - лестница-просто - качественно, оперативно, надежно!
кресло престиж производство
хранилище вещей москва

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)