химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

омогената осадок митохондрий промывают 0,3 М раствором сахарозы и суспендируют в том же растворе.

В четыре конические колбочки на 25 мл наливают по 3 мл среды инкубации одного из следующих составов; 1) 0,3 М сахароза; 2) 0,25М сахароза, 3 мМ фосфат калия (рН 7,4), 15 мМ MgCb, 10 мМ трис-HCl буфер (рН 7,4), 5 мМ сукцинат калия; 3) то же, что (2), но без фосфата; 4) то же, что (2), плюс 100 мкМ 2,4-динитрофенол.

Среды инкубации, содержащие трис, готовят в день опыта непосредственно перед использованием.

Колбочки помещают в термостат аппарата Варбурга при 28° С и выравнивают температуру в течение 15 мин. В каждую колбочку добавляют по 0,1 мл густой суспензии митохондрий (6—7 мг белка) и пробы инкубируют в течение 10 мин при перемешивании. По окончании инкубации их помещают в лед и после быстрого охлаждения их содержимое осторожно наслаивают на поверхность холодного 0,88 М раствора сахарозы. Предварительно охлажденную до 0°С сахарозу разливают по 5—7 мл в четыре центрифужных стаканчика от супернасадки центрифуги ЦЛР, стоящие во льду. Пробы центрифугируют при максимальной скорости вращения 10 мин. Верхний слой отсасывают пипеткой и отбрасывают, раствор сахарозы сливают и поверхность осадков осторожно споласкивают 0,3 М сахарозой, охлажденной до 0°С. В стаканчик добавляют по 1,5 мл 1 н. хлорной кислоты, осадки хорошо размешивают стеклянной палочкой и центрифугируют при 5000g в течение 15 мин. Супернатанты собирают в пробирки и экстракцию повторяют вновь в тех же условиях. Объединенные супернатанты нейтрализуют крепким раствором NH4OH. К нейтрализованным растворам добавляют по 2 мл метилового спирта, 2,5 мл 1 М аммиачного буфера, 0,2 мл раствора цианистого калия и 0,4 мл раствора эриохро-ма черного Т в метиловом спирте. Объем доводят до 10 мл аммиачным буфером. Определяют количество Mg2+ в пробах, измеряя оптическую плотность при 520 нм против раствора, не содержащего Mg2+. Калибровочную кривую строят одновременно с обработкой опытных проб, используя в качестве стандарта титрованный раствор MgCl2. Область концентраций, в которой сохраняется линейная зависимость между количеством Mg2+ и оптической плотностью, — 0—0,3 мкмоль Mg2+ на пробу.

По результатам измерения рассчитывают количество Mg2+ в митохондриях сердечной мышцы и его изменения при инкубации в различных условиях. Полученные результаты оформляют в виде таблицы.

Л Н I С Г Л 1 * Г П

Brier ley G., Murer E., Bauchmann E., et al Studies ion transport. II. The accumulation of inorganic phosphate and magnesium ions by heart mitochondria// //J. Biol. Chem. 1963. Vol. 238. P. 3482.

8. ИЗУЧЕНИЕ КИНЕТИКИ ТРАНСПОРТА НЕОРГАНИЧЕСКОГО ФОСФАТА В МИТОХОНДРИЯХ

Высокая специфичность внутренней мембраны в отношении проницаемости для разных веществ привела к представлению о существовании в ней ферментов-переносчиков. Так как многие субстраты ферментов, локализованных внутри митохондрий, при физиологических значениях рН являются ионами (нуклеотиды, субстраты цикла трикарбоно-вых кислот, неорганический фосфат, катионы и т. д.), представляет интерес идентификация ионных форм транспортируемых веществ. Такие данные важны для понимания конкретного механизма переноса субстрата через мембрану.

Одним из процессов, сопровождающихся переносом неорганического фосфата через мембрану митохондрий, является активный транспорт кальция. Значительные количества Са2+ могут быть аккумулированы митохондриями за счет энергии дыхания только в присутствии проникающих через мембрану анионов. В этом случае активация дыхания при добавлении Са2+ приводит к накоплению во внутримитохондриальном пространстве соответствующих проникающему аниону кальциевых солей. Таким образом, активный транспорт Са2+ сопровождается переносом через мембрану аниона. В физиологических условиях роль такого аниона выполняет неорганический фосфат.

В настоящей работе предлагается провести анализ кинетики переноса неорганического фосфата, сопровождающего активный транспорт Са2+.

Реактивы:

1. Реактивы для выделения митохондрий печени крысы (с. 406).

2. Среда инкубации для опыта 1: 0,15 М сахароза, 75 мМ КО, 10 мМ сукцинат, 3 мкМ ротенон, 10 мМ трис-НО и 0,5 мМ КН2РО4. Готовят несколько сред с различными значениями рН в диапазоне от 6,8 до 8,2 (6—7 точек).

3. Среда инкубации для опыта 2: 0,15 М сахароза, 75 мМ КО, 10 мМ сукцинат, 3 мкМ ротенон, 10 мМ трис-НО и КН2Р04 в концентрациях от 5-10~5 до 5-Ю-3 М. (5—6 точек). Готовят две серии среды с двумя значениями рН, например 7,1 и 7,8.

4. СаС12 — 4-Ю-2 М раствор.

5. Реактивы для определения белка (с, 483).

Подготовку к проведению опыта целесообразно начать с приготовления 0,5 М КН2Р04 (рН 6,8).

Опыт 1. Полярографическая оценка зависимости скорости активного транспорта Са2+ от рН (в диапазоне от 6,8 до 8,2) в присутствии 0,5 мМ КН2Р04 (среда 1). В полярографическую ячейку помещают 2 мл среды инкубации и погружают в нее электроды полярографа. После установления постоянного диффузионного тока в ячейке (около 1 мин) включают диаграммы на самописце КСП-4 и

страница 236
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
продажа фундаментных блоков
малоинвазивные операции на носовой перегородке
малые архитектурные формы для детского сада
электрический насос для мячей

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.06.2017)