химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

троды полярографа осторожно опускают в кювету, заполненную 2 мл среды 1 (проба 1) до полного выхода пузырька воздуха. С помощью специального потенциометра устанавливают перо включенного самописца в исходное положение, соответствующее исходной концентрации кислорода в среде (в самописцах типа КСП-4 — в крайнее правое положение). Включают движение диаграммной ленты и, убедившись в отсутствии дрейфа, с помощью микропипетки добавляют в кювету 0,04—0,05 мл густой суспензии митохондрий (4—6 мг белка). В течение 40—60 с регистрируют медленное эндогенное дыхание и добавляют 0,02 мл сукцината (10 мМ), который вызывает небольшую стимуляцию дыхания. Через 40—60 с в кювету вносят раствор СаС12 (— 100 мкМ). При этом дыхание сначала резко активируется, затем быстро снижается до исходного уровня. Добавку повторяют несколько раз до тех пор, пока стимуляция дыхания после каждого добавления сменяется четко выраженным торможением. Учитывая количество добавленного СаС12, оценивают его максимальную концентрацию, вызывающую обратимую стимуляцию дыхания. Для препарата интактных прочно сопряженных митохондрий (4—6 мг белка в кювете) эта концентрация обычно составляет 400—500 мкМ. В пробе 2 убеждаются в том, что выбранная концентрация СаС12 вызывает обратимую стимуляцию дыхания с отчетливым выходом в контролируемое состояние. Для определения величины АДФ/О записывают следующую пробу. С этой целью в кювету со средой последовательно добавляют митохондрии, сукцинат и АДФ в концентрации от 300 до 400 мкМ (определение АДФ/О см. на с. 462). Проводят три аналогичных измерения с использованием в качестве субстрата окисления смесь глутамат—ма-лат (по 5 мМ). В этом случае целесообразно уменьшить концентрацию добавляемого СаС12 в 1,5—2 раза, а в среду инкубации предварительно добавить (непосредственно в кювету) 1 мМ НАД+ для предотвращения утечки эндогенных пиридиннуклеотидов.

Отношение Са/О рассчитывают аналогично тому, как описано на с. 462 для коэффициента АДФ/О. Полученные данные представляют в виде таблиц и документируют полярограммами.

Ингибиторы транспорта кальция. В работе предлагается ознакомиться с некоторыми особенностями системы аккумуляции Са2+ в митохондриях. С этой целью ставят серию проб по следующей схеме.

Проба 1. В среду 1 добавляют митохондрии (4—6 мг белка), сукцинат (10 мМ), 2,4-динитрофенол (50 мкМ) и определяют сукцинато-ксидазную активность препарата.

Проба 2. В среду 1, содержащую 30 мкМ л-хлормеркурибензоат (добавить непосредственно в кювету), добавляют митохондрии, сукцинат, СаС12 (в концентрации приблизительно 400 мкМ), АДФ (300— 400 мкМ) и 50 мкМ 2,4-динитрофенол. Убеждаются в том, что я-хлор-меркурибензоат ингибирует аккумуляцию Са2+ и окислительное фосфорилирование, но не влияет на сукцинатоксидазную активность митохондрий.

Проба 3. В среду 2, содержащую 30 мкМ п-хлормеркурибензоат добавляют митохондрии, сукцинат, СаС12 и 2,4-динитрофенол. Убеждаются в том, что в присутствии ацетата я-хлормеркурибензоат не влияет на транспорт Са2+ и сукцинатоксидазную активность.

Проба 4. В среду 1, содержащую n-хлормеркурибензоат, добавляют митохондрии, сукцинат, СаС12, 20 мМ ацетат, 2,4-динитрофенол (для быстрого исчерпания кислорода в среде). Убеждаются в том, что ацетат снимает вызванное n-хлормеркурибензоатом торможение транспорта Са2+.

Проба 5. В среду 1, содержащую 1 мкМ рутениевый красный (добавить непосредственно в кювету), добавляют митохондрии, сукцинат и 2,4-динитрофенол. Убеждаются в отсутствии чувствительности сукцинатоксидазной активности митохондрий к рутениевому красному.

Проба 6. В среду 1, содержащую рутениевый красный, добавляют митохондрии, сукцинат, СаСЬ, АДФ и 2,4-динитрофенол. Убеждаются в том, что рутениевый красный полностью блокирует активный транспорт Са2+ и не влияет на окислительное фосфорилирование.

Проба 7. Повторяют пробу 6 в среде 2 (плюс рутениевый красный). Убеждаются в том, что ингибирующее действие рутениевого красного не зависит от природы сопровождающего аниона.

Проба 8. В среду 1 добавляют митохондрии, сукцинат, 200 мкМ СаС12. После выхода в контролируемое состояние добавляют 30 мкМ n-хлормеркурибензоат и вслед за ним — еще 200 мкМ СаС12. Убеждаются в отсутствии стимуляции дыхания после второй добавки СаС12. Добавляют 20 мМ ацетат и наблюдают обратимую стимуляцию дыхания, связанную с поглощением добавленного ранее кальция. В кювету вносят 1 мкМ рутениевый красный и вслед за ним еще 200 мкМ СаС12 и 2,4-динитрофенол. Вновь убеждаются в торможении активного транспорта Са2+ при неизменной сукцинатоксидазной активности митохондрий. Полученные данные анализируют с учетом природы ингиби-рующего действия л-хлормеркурибензоата и рутениевого красного на активный транспорт Са?+ в митохондриях. Данные оформляют в виде полярограмм.

ЛИТЕРАТУРА

1. Chance В. The energy-linked reaction of calcium with mitochondria//J. Biol. Chem. 1965. Vol. 240. P. 2729.

2. Fonyo A., Ligeti E. The role of intramitochondrial inorganic phosphate in stimulation of respiration by calcium and stronti

страница 233
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
стоимость всех комплектующих вентилятор vl 60-35/28-2d

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(20.02.2017)