химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

угированием суспензии в 0,88 М раствора сахарозы. Предварительно охлажденную до 0° С сахарозу разливают по 7 мл в 4 центрифужные пробирки от супернасадки ЦЛР-1, стоящие на льду. После инкубации колбы быстро охлаждают и их содержимое осторожно с помощью пипетки наслаивают на поверхность раствора 0,88 М сахарозы. Осторожно помещают пробирки в охлажденный ротор супернасадки и центрифугируют при максимальной скорости вращения (18 000 об/мин) в течение 10 мин. Верхний слой отсасывают пипеткой, а раствор сахарозы сливают. Добавляют в центрифужные стаканчики по 1,5 мл 5%-ной трихлоруксусной кислоты, осадки тщательно размешивают стеклянной палочкой и центрифугируют при 5000 g 10 мин. Супернатанты собирают в пробирки и экстракцию повторяют еще раз. Объединенные супернатанты нейтрализуют концентрированным раствором NaOH, добавляют 1 мл 1 М раствора NaOH и объем доводят до 10 мл бидистиллированной водой. Прибавляют индикатор (смесь мурексида с NaCl) и тотчас титруют раствором ЭДТА до перехода окраски в фиолетовую. Определение Са2+ см. на с. 484. Рассчитывают количество Са2+ в митохондриях печени крысы и его изменения в ходе инкубации в различных условиях. Полученные результаты оформляют в виде таблицы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Ленинджер А. Митохондрии. М., 1968.

2. Lehninger A. L, Carafoli Е., Rossi С. S. Energy-linked ion movement in mitochondria//Adv. in Enzymol. 1967. Vol. 29. P. 259.

3. Lehninger A. L. Mitochondria and calcium ion transport. The fifth jubilee lectu-re//Biochem. J. 1970. Vol. 119. P. 129.

5. ПОЛЯРОГРАФИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОГО ТРАНСПОРТА КАЛЬЦИЯ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ

Митохондрии активно транспортируют ионы Са2+ и некоторых других двувалентных металлов. Добавление Са2+ (200—300 нмоль/мг белка) к аэробной суспензии митохондрий в присутствии субстрата окисления вызывает стимуляцию дыхания. Когда практически весь добавленный Са2+ окажется во внутреннем пространстве митохондрий, скорость потребления кислорода возвращается к исходному уровню (контролируемое состояние). Отношение количества дооавленного и-1 к количеству поглощенного кислорода (Са/О) варьирует от 4 (при окислении сукцината — два пункта сопряжения) до 6 (при окислении НАД-зависимых субстратов — три пункта сопряжения). Отношение величины Са/О к величине АДФ/О для одного и того же митохондриального препарата характеризует количество ионов Са2+, проводящее через мембрану за счет энергии переноса двух электронов через один пункт сопряжения в дыхательной цепи.

Значительные количества Са2+ могут быть накоплены в митохондриях только в присутствии проникающего аниона в среде инкубации, например фосфата или ацетата. Перенос фосфата через мембрану осуществляется с помощью специфического фермента-переносчика, активность которого подавляется низкими концентрациями SH-ядов. В присутствии сульфгидрильных ядов митохондрии неспособны к окислительному фосфорилированию и накапливают очень ограниченное количество Са2+. Добавление АДФ или Са2+ в таких условиях не стимулирует дыхания. Последующее добавление ацетата, перенос которого нечувствителен к этим ядам, стимулирует дыхание и обеспечивает транспорт добавленного ранее Са2+ во внутреннее пространство митохондрий.

К специфическим ингибиторам переносчика Са2+ в мембране относится комплексная соль рутения [Кщ02(МНз) ]4]С1б-4Н20, используемая в гистохимической практике в качестве красителя на мукополиса-^ариды (рутениевый красный). Присутствие последного не влияет на дыхание и окислительное фосфорилирование, но полностью исключает стимуляцию дыхания при добавлении Са2+. В таких условиях Са2+. остается во внемитохондриальном пространстве.

В настоящей работе предлагается ознакомиться с основными функ-диональными особенностями системы активного транспорта Са2+ в митохондриях.

Реактивы:

1. Реактивы для выделения митохондрий печени крысы (с. 406).

2. Сахароза — химически чистый препарат.

3. КН2Р04 — 0,5 М раствор, рН 7,4.

4. Ацетат калия — 2 М раствор, рН 7,4.

5. Сукцинат калия—1 М раствор, рН 7,4.

6. Смесь 0,5 М глутамата и 0,5 М малата калия, рН 7,4.

7. 2,4-динитрофенол — 0,01 М раствор, рН 7,4.

8. Рутениевый красный — 1 ? 10-4 М раствор.

9. п-Хлормеркурибензоат — 4- Ю-3 М раствор, рН 7,4.

10. АДФ — 3-10-2 М раствор, рН 7,4.

11. СаС12 — 5-10~2, 4- Ю-2, 3-10~2, 2-10~2 и 1-10-2 М растворы.

12. MgCl2 — 0,25 М раствор.

Растворы СаС12 и MgCl2 готовят разведением титрованных растворов.

13. КО — 1 М раствор.

14. Ротенон — 3-10-4 М. раствор в этиловом спирте. При использовании сукцината в качестве субстрата окисления все пробы

должны содержать 3 мкМ ротенона (добавлять непосредственно в кювету).

15. НАД+ — 100 мМ раствор.

Измерение активного транспорта Са2+ в митохондриях. В день опыта готовят две среды инкубации (по 50 мл) следующего состава: w — w,iu i*i cdAapocja, u,u/D M 2,0 мМ MgCl2 и 5 мМ KH2P04

(рН 7,4); (2) — 0,15 М сахароза, 0,075 М КС1, 2,5 мМ MgCl2, 20 мМ ацетат калия и 10 мМ трис-HCl (рН 7,4).

Отмытые и подсушенные с помощью кусочка фильтровальной бумаги элек

страница 232
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
кресло престиж кожзам
Фирма Ренессанс деревянные винтовые лестницы - продажа, доставка, монтаж.

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(29.04.2017)