химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ейлина—Хартри и (или) уменьшить концентрацию вносимого Q2. Повторяют измерение с другими гомологами убихинона: Qi (3 мкМ) и Qe (3 мкМ). Убеждаются в полной чувствительности наблюдаемой убихинон-редуктазной активности (измеренной с различными гомологами убихинона) к ротенону. С этой целью в кювету по ходу реакции вносят 5 мкМ ротенон и наблюдают полное ингибирование реакции.

Примечание. Следует тщательно отмывать электрод полярографа и кюветы 50%-ным спиртом, а затем много раз водой от ротенона» сильно сорбирующегося на оргстекле.

ЛИТЕРАТУРА

1. Rag an С, I., Н inkle Р. С. Ion transport and respiratory control in vesicles formed from reduced nicotinamide adenine dinucleotide coenzyme Q reductase and phospholipids//.!. Biol. Chem. 1975. Vol. 250. P. 8472.

2. R a g a n С. I., Cottingham I. R. The kinetics of quinone pools in electron trans-port//Biochim. Biophys. Acta. 1985. Vol. 811. P. 13.

3. W i k s t г о m M. Two protons are pumped from the mitochondrial matrix per electron transferred between NADH and ubiquinone//FEBS Lett. 1984. Vol. 169. P. 300.

4. Николе Д. Дж. Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию. М., 1985.

4. ИНГИБИРОВАНИЕ НАДН-ОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ РОТЕНОНОМ

НАДН:убихинон-оксидоредуктазный комплекс дыхательной цепи митохондрий (комплекс I — см. с. 415) катализирует реакцию окисления НАДН эндогенным убихиноном. Активность НАДН:убихинон-оксидоредуктазы специфически ингибируется такими веществами, как амитал, пиерицидин, реин и ротенон. Последний ингибитор наиболее широко применяется при изучении переноса электронов в дыхательной щепи и молекулярной организации комплекса I. Ротенон обладает сильно выраженными гидрофобными свойствами и способен помимо НАДН:убихинон-оксидоредуктазы взаимодействовать с гидрофобными участками многих белков, в частности бычьего сывороточного альбумина, и фосфолипидными мембранами.

В настоящей работе предлагается изучить кинетику торможения НАДН-оксидоредуктазной активности препарата Кейлина—Хартри ро-теноном и определить кинетические и термодинамические параметры связывания ингибитора с ферментом. Реакция окисления НАДН кислородом сопровождается поглощением стехиометрического протона и может быть измерена с помощью регистрирующего рН-метра.

Реактивы и оборудование:

1. Реактивы для получения препарата Кейлина—Хартри (с. 407).

2. Среда измерения активности, содержащая 0,15 М сахарозу, 75 мМ КС1, 5 мМ фосфат калия (рН 7,4) и цитохром с 20 мкг/мл.

3. Среда измерения активности (см. 2), содержащая альбумин из бычьей сыворотки 20 мг/мл.

4. НАДН — 0,1 М раствор, рН 7,4.

5. Ротенон — 1 мМ раствор в перегнанном этаноле.

6. Регистрирующий рН-метр с набором кювет и микропинсюл объемом 0,02—0,1 мл.

Определение константы скорости инактивации фермента ротено-ном. Выделяют препарат Кейлина—Хартри. Кювету рН-метра (объемом 4,5 мл) заполняют средой измерения активности (п. 2) и добавляют НАДН до конечной концентрации в кювете, равной 1 мМ. В кювету погружают отмытый рН-электрод, через 2—3 мин вносят 50 мкл суспензии Кейлина—Хартри ( — 25 мг/мл) и регистрируют изменение рН в ходе НАДН-оксидазной реакции. По ходу реакции в кювету вносят ротенон (0,1 мкМ) и наблюдают ингибирование ферментативной активности, связанное с образованием каталитически неактивного комплекса фермент-ротенон. Внося ингибитор в различных концентрациях (0,025; 0,05; 0,075; 0,1; 0,15 мкМ), определяют зависимость скорости инактивации от концентрации ротенона и рассчитывают величину .константы второго порядка скорости инактивации фермента ингибитором.

Определение константы скорости активации фермента, блокированного ротеноном. В стеклянную пробирку, стоящую на льду, вносят 1 мл суспензии Кейлина—Хартри (25 мг/мл). Измеряют НАДН-окси-дазную активность, как указано выше. Измерение повторяют в среде, содержащей бычий сывороточный альбумин (20 мг/мл). После этого в инкубационную пробирку вносят 5 мкл ротенона из спиртового раствора и инкубируют 30 мин. Измеряют активность фермента в среде

Л Л 1

без альбумина и убеждаются в инактивации комплекса I в результате инкубации с ротеноном. При измерении реакции с альбумином наблюдают быструю активацию заингибированного фермента во времени. Процесс активации обусловлен диссоциацией каталитически неактивного комплекса фермент-ротенон; альбумин, присутствующий в среде, связывает ротенон и смещает равновесие в сторону диссоциации комплекса фермент-ингибитор. Определяют константу первого порядка скорости активации заингибированного фермента в среде с альбумином. Предлагается, исходя из значений констант скоростей образования и распада комплекса, определить величину Лд комплекса фермент-ротенон.

Примечания. 1. При работе с ротеноном необходимо тщательно отмывать рН-электрод 50%-ным этиловым спиртом, а затем водой. 2. При измерении активности на рН-метре необходимо после завершения каждого измерения определять цену деления шкалы на самописце. Для этого в кювету вносят небольшой объем (0,02—0,05 мл) титрованной НС1 (50 мМ

страница 227
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы бухгалтер по зарплате и кадрам на базе вуза в москве
ремонт холодильника Sharp SJ-340NBE
купить кухонный стол стеклянный
вентилятор канальный vksв 600х300-4 l1

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)