химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

реакции окисления сукцината и НАДН кислородом (см. рис. 48, с. 415). В настоящее время установлено, что функционирование комплексов I, III и IV

сопряжено с генерацией Ам-# + - Изучение механизма функционирования комплексов в составе нативных митохондрий спектрофотометриче-ским методом затруднено из-за сильного светорассеяния митохондри-альной суспензии. Неточности, возникающие в ходе спектральных измерений, могут быть источником ошибок в определении параметров ферментативных реакций. Это в полной мере относится к НАДН:уби-хинон-оксидоредуктазе. Для измерения реакции, катализируемой комплексом I в составе нативных митохондрий, в настоящей задаче предлагается использовать подход, позволяющий регистрировать ферментативную активность на полярографе. Принцип метода показан на рис. 52.

Митохондрии, обработанные антимицином А (ингибитором транспорта электронов от убихинона на кислород), катализируют реакцию окисления субстратов дыхания добавленными низкомолекулярными гомологами убихинона (Q). Образующийся в ходе реакции хинол (QH2) окисляется затем кислородом в реакции, катализируемой суб-митохондриальными фрагментами. В присутствии избыточного количества субмитохондриальных частиц скорость поглощения кислорода в такой системе определяется активностью НАДН:убихинон-оксидоредук-тазного участка митохондрий. Описанный подход позволяет измерять убихинон-редуктазную реакцию в мутных средах в присутствии низких концентраций убихинона.

Рис. 52. Участие экзогенного убихинона в переносе восстановительных эквивалентов из обработанных антимицином А митохондрий в дыхательную цепь СМЧ

В настоящей задаче предлагается с использованием описанного подхода изучить функционирование НАДН:убихинон-оксидоредуктазы в интактных митохондриях печени крысы и продемонстрировать генерацию трансмембранного потенциала при восстановлении убихинона комплексом I.

Реактивы и оборудование:

1. Реактивы для выделения препарата Кейлина—Хартри (с. 407).

2. Реактивы для выделения митохондрий из печени крысы (с. 406).

3. Сахароза — 0,25 М раствор, содержащий 1 мг/мл БСА, освобожденного от жирных кислот, рН 8,0.

4. Среда инкубации, содержащая: 0,15 М сахарозу, 75 мМ КО, 5 мМ фосфат калия, 2,5 мМ MgCl2, 0,2 мМ ЭДТА, 0,5 мг/мл БСА, освобожденного от жирных кислот.

5. Глутамат калия — 0,5 М раствор, рН 8,0.

6. Малат калия — 0,5 М раствор, рН 8,0.

7. Антимицин А — раствор в перегнанном этаноле, 1 мг/мл.

8. Qi, Q2, Qe — 0,5 М растворы в перегнанном этаноле.

9. 2,4-динитрофенол — 10 мМ раствор, рН 8,0.

10. Ротенон — 1 мМ раствор в перегнанном этаноле.

11. Полярограф с набором кювет, набор микропипеток объемом 0,02—0,05 мл и микрошприц объемом 0,01 мл.

Выделяют субмитохондриальные фрагменты из сердца быка (препарат Кейлина—Хартри, см. с. 407). Полученные в ходе выделения осадки суомитохондриальных частиц, суспендируют в небольшом объеме 0,25 М сахарозы, содержащей 1 мг/мл БСА, свободного от жирных кислот, разливают по небольшим пластиковым ампулам и хранят либо-в жидком азоте, либо при температуре —20° С.

Выделяют митохондрии из печени крысы (с. 406). Последнюю промывку и суспендирование митохондрий проводят в 0,25 М сахарозе,, содержащей 1 мг/мл БСА, освобожденного от жирных кислот.

В кювету полярографа помещают 2 мл среды инкубации (п. 4), погружают электроды и устанавливают положение пера самописца в исходное положение. Добавляют примерно 50 мкл густой ( — 100 мг/мл) суспензии митохондрий. Через 1—2 мин в кювету добавляют глутамат и малат до конечной концентрации, равной 5 мМ. Регистрируют постоянную скорость дыхания и через 1—2 мин добавляют 100 мкМ 2,4-динитрофенол. Наблюдают увеличение скорости поглощения кислорода.

Митохондриальную суспензию (1 мл) переносят в небольшую стеклянную пробирку, добавляют микрошприцем 4 мкл раствора анти-мицина А и инкубируют 20—30 мин при 0° С. Определяют малатокси-дазную активность митохондрий, как описано ранее. Наблюдают практически полное ингибирование активности, измеренной в присутствии динитрофенола. В том случае, если активность сохраняется, добавляют 1 мкл раствора антимицина А и повторяют измерение. Подбирают минимальное количество ингибитора, необходимое для практически полного (^90%) блокирования малатоксидазной активности.

В полярографическую кювету, содержащую 2 мл среды инкубации» погружают электроды, вносят 50 мкл суспензии обработанных анти-мицином митохондрий, добавляют 5 мМ малат и 5 мМ глутамат и через 1—2 мин вносят 50 мкл густой (50—70 мг/мл) суспензии препарата Кейлина—Хартри. Внесение субмитохондриальных фрагментов практически не вызывает стимуляции поглощения кислорода. Реакцию инициируют добавлением 4 мкМ Q2 (осуществляющего перенос электронов между митохондриями и субмитохондриальными фрагментами, неспособными окислять малат). По ходу реакции добавляют 100 мкМ динитрофенол и регистрируют увеличение скорости поглощения кислорода. В том случае, если стимуляция разобщителем не наблюдается, рекомендуется вдвое понизить количество вносимого препарата К

страница 226
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
мяч для флорбола купить
j,]zdktybz j c,jht chtlcnd yf ktxtybt
купить билеты на лепса крокус сити холл
купить стол на кухню белый со стеклом

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.09.2017)