химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

спензии добавляют 15 мл 10%-ного раствора холата натрия (конечная концентрация — 2%). Добавляют твердый сульфат аммония до насыщения 25% (0,136 г/мл), рН суспензии доводят до 7,7 с помощью 1 М. NaOH и оставляют на ночь.

Смесь центрифугируют 30 мин (во всех случаях здесь и далее центрифугирование проводят при 22 000g), осадок отбрасывают. К прозрачному, зеленовато-коричневому супернатанту добавляют твердый сульфат аммония до насыщения 40% (0,086 г/мл). Через 10 мин смесь центрифугируют в течение 15 мин. Светло-оранжевый супернатант отбрасывают, зеленовато-коричневый осадок растворяют в 20 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащем 1,5% холата натрия. К прозрачному раствору добавляют насыщенный раствор сульфата аммония до тех пор, пока не появляется легкая, но заметная муть. Обычно это количество составляет около 7,5 мл (насыщение сульфата аммония — 24—26%). Смесь оставляют на 30 мин, затем центрифугируют 20 мин. Небольшой осадок отбрасывают. К прозрачному супернатанту добавляют насыщенный сульфат аммония до насыщения 37%. Для расчета необходимого количества сульфата аммония пользуются формулой, приведенной на с. 200.

После добавления сульфата аммония иногда выпадает темный вязкий осадок, который сильно прилипает к стенкам стеклянного стакана. Рекомендуется осаждение сульфатом аммония проводить прямо в центрифужном стакане: раствор сульфата аммония добавляют по каплям из делительной воронки, а содержимое стакана при этом постоянно встряхивают. Смесь центрифугируют 20 мин после 10 мин инкубации. Осадок растворяют в 16 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 1,5%-ный холат натрия. Снова добавляют насыщенный сульфат аммония до появления легкой мути. Через 30 мин смесь центрифугируют 20 мин, осадок отбрасывают, а супернатант насыщают сульфатом аммония до 36%. Через 10 мин смесь центрифугируют 20 мин. Осадок растворяют в 12 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 1%-ный твин-80. К раствору добавляют насыщенный сульфат аммония до появления легкой мути, осадок отделяют центрифугированием 20 мин, а к супернатанту добавляют насыщенный сульчрат аммония до насыщения 35%. Через 10 мин центрифугируют 20 мин. Осадок растворяют в 12 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 1%-ный твин-80 и повторяют процедуру ступенчатого фракционирования 2 раза, при этом «верхнее» насыщение снижают каждый раз на 1%- Осадок после последнего фракционирования растворяют в 1 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН «7,4), содержащего 0,25%-ный твин-80. Для удаления остатков сульфата аммония и холата натрия, который ингибирует цитохромоксидазу, препарат диализуют в диализной трубке против 1 л 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 0,25%-ный твин-80. Через 4 ч после начала диализа буфер меняют и диализ оставляют на ночь. Полученный препарат цитохромоксидазы хранят в жидком азоте.

Определение белка в препарате цитохромоксидазы. Содержание белка в полученном препарате измеряют с биуретовым реактивом (с. 483) в модификации Ионетани [3], которая состоит в том, что к раствору цитохромоксидазы перед добавлением биуретового реактива добавляют 0,05 мл 30%-ного раствора перекиси водорода. Такая обработка фермента позволяет уменьшить вклад поглощения фермента в оптическую плотность комплекса белка с биуретовым реактивом.

Определение содержания гема а в препарате цитохромоксидазы. В кювету спектрофотометра помещают 2 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 1,5%-ный холат натрия, и 0,1 мл полученного препарата. Измеряют оптическую плотность раствора при 605 нм. Затем фермент восстанавливают, добавляя несколько кристаллов дити-•онита. Через 10 мин регистрируют значение оптической плотности раствора при 605 нм. Концентрацию гема а рассчитывают, исходя из разности коэффициентов молярной экстинкции окисленной и восстановленной форм гема, которая при 605 нм составляет 12-Ю3 М-1 см-1. Высокоочищенные препараты цитохромоксидазы, выделенные предложенным методом, содержат около 11 нмоль гема а на 1 мг белка фермента.

Измерение активности цитохромоксидазы. Активность фермента измеряют полярографическим методом {с. 480) по поглощению кислорода из среды измерения. В кювету полярографа помещают 2 мл 0,05 М фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 1%-ный твин-80. Добавляют 0,04 мл 1 М аскорбиновой кислоты и 0,08 мл 2 мМ цитохрома с. Кювету устанавливают в штатив полярографа, дожидаются, пока значение тока выйдет на постоянный уровень, и реакцию начинают добавлением препарата цитохромоксидазы (10—100 мкг). Из по-лярограммы находят величину каталитической активности фермента и рассчитывают число его оборотов.

Студентам предлагается самостоятельно:

1. Оценить степень чистоты выделенного препарата.

2. Изучить зависимость скорости реакции от концентрации цитохрома с.

3. Изучить зависимость числа оборотов фермента от концентрации цитохромоксидазы в среде измерения активности.

ЛИТЕРАТУРА

1. Kuboyama М., Young F. C,King Т. Е. Studies on cytochrome oxidase. VIII. Preparation and some properties of cardiac cytochrome oxidas

страница 223
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
проявление склеродермии у взрослых
обслуживание чиллеров hiref прайс
мебель боккаччо комод сайт
обучение по обслуживанию газовых котлов во владимире

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(21.08.2017)