химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ифугируют 30 мин при 40 000 g. Осадок (если имеется) отбрасывают, а к ярко-красному прозрачному супернатанту медленно добавляют равный объем нейтрализованного насыщенного при комнатной температуре сульфата аммония. Помутневший раствор перемешивают 20 мин и центрифугируют 20 мин при 15 000^. Плотный, ярко-красный, вязкий осадок3 растворяется медленно, в небольшом объеме раствора, содержащего 0,25 М сахарозу и 20 мМ фосфатный буфер, рН 7,4. Нерастворившийся материал отделяют центрифугированием в течение 20 мин при 20 000^. Прозрачный ярко-красный раствор содержит убихинонщитохром с-редуктазу.

Раствор фермента помещают в подготовленную заранее диализную трубку и диализуют на холоде против 10—20-кратного забуференного раствора 0,25 М сахарозы в течение 24 ч, трижды меняя буфер. Полученную суспензию разливают в подходящие полиэтиленовые сосудики и хранят в замороженном состоянии при —20° С или в жидком азоте.

Измерение активности убихинонщитохром с-оксидоредуктазы„ В качестве естественных субстратов для комплекса III служат восстановленный убихинон (убихинол) и окисленный цитохром с. Природные убихинон и убихинол, содержащие 10 изопреноидных остатков в боковой цепи, совершенно нерастворимы в воде. В связи с этим для измерения активностей ферментов, для которых убихинон служит либо донором электронов, либо акцептором, приходится принять искусственные гомологи, или аналоги убихинона. Антимицинчувствительная уби-хинолщитохром с-редуктазная активность может быть измерена в водных средах с использованием гомолога убихинона — Q2 (два изопреноидных остатка в боковой цепи) или его аналога — дурохинола (восстановленный 2,3,5,6-тетраметилбензохинон).

3 Иногда при центрифугировании липопротеид всплывает и происходит его сорбция на стенке центрифужной пробирки. В этих случаях всплывший материал следует тщательно собрать, осторожно отсосав раствор из пробирки с помощью пастеровской пипетки. Дальнейшие процедуры проводят, как указано.

л ол

Приготовление убихинола (СЬН2). В пробирке со шлифом объемом около 10 мл помещают 10 мг Q2 и растворяют в 3 мл этилового спирта. Добавляют равный объем воды и деаэрируют (продувают 5— 10 мин аргоном с помощью пастеровской пипетки, соединенной с кислородной подушкой, заполненной аргоном). В пробирку вносят несколько кристаллов гидросульфита (дитионита) натрия и 5—10 мг кристаллического КО. Содержимое пробирки помешивают в токе аргона до полного обесцвечивания раствора (3—5 мин). К раствору добавляют 2 мл деаэрированного циклогексана, пробирку закрывают, встряхивают 2—3 мин и оставляют до полного расслоения фаз. Верхнюю фазу, содержащую хинол в циклогексане, отбирают пастеровской пипеткой и переносят в небольшой сосуд для дальнейшего упаривания в роторном испарителе. Экстракцию циклогексаном повторяют, экстракты объединяют и упаривают досуха в роторном испарителе (конси

стенция масла). Масло растворяют в 1,5 мл абсолютного этанола, к которому добавляют 2 мкл 1 н. НС1. Раствор хорошо сохраняется в течение нескольких дней при хранении на холоде (—20° С) в плотно закрытом сосуде, заполненном аргоном. При аутоокислении раствор желтеет.

Приготовление дурохинола, В пробирку со шлифом объемом на ~ 10 мл готовят 30 мМ раствор дурохинола в деаэрированном (см. выше) метаноле. К раствору добавляют несколько кристаллов сухого боргидрида натрия и смесь перемешивают до полного исчезновения желтой окраски. Избыток боргидрида разлагают добавлением 20 мкл 3 н. НС1, пробирку заполняют аргоном, плотно закрывают и хранят на холоде в течение опыта (5—6 ч). При аутоокислении раствор желтеет.

Измерение Q2H2 (дурохинол):цитохром ?-редуктазной активности.

Устанавливают длину волны регистрирующего прибора на отметке 550 нм, как указано на с. 412. Кювету спектрофотометра, заполненную раствором, содержащим 20 мМ фосфатный буфер, 50 мкМ ЭДТА, 20 мкМ цитохром с и 1 мг/мл бычьего сывороточного альбумина, помещают в прибор. В кювету добавляют дурохинол (конечная концентрация 60 мкМ) или Q2H2 (конечная концентрация 50 мкМ) и регистрируют в течение 1 мин неэнзиматическое восстановление цитохрома с хинолом. В кювету вносят препарат фермента (~2 мкг/мл, если донором служит Q2H2 и —20 мкг/мл, если донором служит дурохинол) и регистрируют прирост скорости восстановления цитохрома с. Ферментативную активность рассчитывают по разнице скоростей реакции в присутствии и в отсутствие фермента и выражают в микроэлектрон-эквивалентах за 1 мин в расчете на 1 мг белка. Ферментативная активность полностью подавляется антимицином А.

Студенту предлагается самостоятельно выполнить следующие задачи:

1) получить кривую титрования активности фермента антимицином А;

2) изучить влияние преинкубации фермента с фосфолипидами на его активность;

3) осуществить реконструкцию сукцинатщитохром с-оксидоредуктазы из сукцинатдегидрогеназы (с. 415) и убихинолщитохром с-оксидоредуктазы.

ЛИТЕРАТУРА

1. Rieske J. S., Hansen R. E., Zaugg W. S. Studies on the electron transfer system. LVIII. Properties of a new oxidation-reduction comp

страница 221
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Выгодно кликнуть на ссылку - скидка в KNS по промокоду "Галактика" - CE390X - офис продаж в Москве, доставка заказов по всей России.
стеклянная мебель для офиса
ремонт холодильников недорого
Набор для чаепития эгоиста Cactus

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(17.01.2017)