химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

яют холат натрия (рН 7,4) из 10—20%-ного раствора до конечной концентрации 1%. К суспензии, содержащей детергент, небольшими порциями шпателем добавляют мелко растертый сульфат аммония из расчета 144 г/л. После добавления каждой трети требуемого количества сульфата аммония рН суспензии проверяют и при необходимости доводят до 7,4 концентрированным раствором аммиака. Смесь оставляют при хорошем перемешивании на холоде на 1 ч и после этого добавляют сульфат аммония из расчета 61 г/л. рН суспензии проверяют и при необходимости доводят до 7,4. Спустя 20 мин смесь центрифугируют при 40 000 g в течение 1 ч. Прозрачный красно-оранжевый супернатант сливают в охлажденный мерный цилиндр через 4 слоя марли, избегая вспенивания и загрязнения супернатанта рыхлым слоем осадка.

Осадок сохраняют в виде замороженной при —20° С суспензии и используют для получения цитохромоксидазы (с. 432).

К известному объему супернатанта на холоде при хорошем перемешивании медленно добавляют сульфат аммония (каждую следующую порцию после полного растворения предыдущей) из расчета 94 г на 1 л супернатанта. Через 20 мин помутневшую смесь центрифугируют 30 мин при 40 000 Супернатант после центрифугирования отбрасывают, осадок растворяют, помешивая палочкой, или в свободном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в 1/4 исходного объема суспензии препарата Кейлина—Хартри в смеси, содержащей ОД М фосфатный буфер, 0,5%-ный холат и 0,2 мМ ЭДТА (натриевые соли), рН 7,4. Прозрачный или слегка мутный раствор оставляют при слабом перемешивании в холодной комнате на ночь.

Помутневшую за ночь суспензию (выпадение в осадок примесей цитохромоксидазы) центрифугируют 1,5 ч при 78 000Прозрачный красный супернатант тщательно отделяют от мелкодисперсного осадка и помещают в диализную трубку. Отрезок диализной трубки подходящей длины готовят кипячением в течение 1—2 ч в 1%-ном бикарбонате калия, содержащем ОД мМ ЭДТА, и тщательным промыванием бидистиллятом. Завязанную с обоих концов диализную трубку, содержащую прозрачную сукцинатщитохром с-редуктазу, помещают в большой стакан, снабженный магнитной мешалкой, и оставляют для диализа в холодной комнате против примерно 20 объемов раствора, содержащего 0,25 М сахарозу, 10 мМ фосфат натрия, 0,2 мМ ЭДТА, рН 7,4. Диализный буфер меняют дважды: через 3—4 ч после начала диализа и на ночь. На следующий день мутное содержимое диализной трубки центрифугируют 1 ч при 40 000 полученный осадок тщательно суспендируют в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком в небольшом объеме раствора, содержащего 0,5 М сахарозу, 10 мМ Tpnc-S04, 0,2 мМ ЭДТА, рН 7,5, разливают в полиэтиленовые сосудики по порциям, требуемым для* дальнейших опытов, и замораживают. Препарат хорошо сохраняется при длительном хранении при —20° С и неопределенно долго может храниться в жидком азоте. Для выбора объемов замораживаемых образцов следует тщательно спланировать дальнейшие эксперименты, так как при повторных замораживаниях и оттаиваниях препарат теряет каталитическую активность.

Измерение активностей препарата. Подготовка препарата. Сукци-натдегидрогеназа способна связывать в активном центре оксалоацетат с чрезвычайно высоким сродством. Процесс диссоциации ингибитора очень медленный, особенно при низких температурах. В свази с этим при измерении любых активностей митохондриальных ферментов, в которых участвует дегидрирование сукцината, необходимо быть уверенным, что сукцинатдегидрогеназа находится в активном состоянии. С этой целью обычно поступают следующим образом: препарат фермента преинкубируют с сукцинатом {конечная концентрация 10— 20 мМ, что много больше Ks) в условиях, при которых его валовое окисление невозможно (анаэробиоз, отсутствие добавленных акцепторов, присутствие цианида для блокирования цитохромоксидазы). Пре-инкубацию проводят при —30° С в течение 30 мин. За это время происходит полное вытеснение оксалоацетата из активного центра фермента. Этот процесс называют «активацией» сукцинатдегидрогеназы.

Полученную сукцинат:цитохром с-оксидоредуктазу суспендируют в 25 мМ фосфатном буфере, содержащем 0,1 мМ ЭДТА и 20 мМ сукцинат калия, рН 7,4—7,8, при 30° С в течение 30 мин. Препарат помещают на лед или оставляют на время опыта при комнатной температуре.

Регистрация активности. А. Кювету спектрофотометра заполняют раствором, содержащим 25 мМ фосфатный буфер, 0,1 мМ ЭДТА, 20 мМ сукцинат калия и 40 мкМ цитохром с, рН 7,4. Устанавливают длину волны регистрации 550 нм, как описано на с. 412. Реакцию начинают внесением активированного препарата (~2—10 мкг/мл среды измерения) фермента и рассчитывают его активность в микромолях окисленного сукцината за 1 мин на 1 мг белка. Коэффициент молярной экс-тинкции для восстановленного цитохрома с (Аг<&0—А%*0)=\8. Б. В связи с тем что цитохром с служит акцептором электронов, но не протонов, сукцинат: цитохром с-редуктазная активность при рН>6 может быть записана в виде:

сукцинат-2 + 2 цитохром солг-^фумарат-2 + 2 цитохром сг^ + 2Н+, и активность фермента может быть прослежена по выделению Нойо

страница 219
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
снять авто в прокат с водителем
апекс housefit dh-8157
Шумоизоляция автомобиля VIP (хэчбеки и седаны малого класса)
gustavberg

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(31.03.2017)