химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

по 100 мкл и замораживают в жидком азоте.

Определение концентрации белка в препарате СУР. 40 мкл препарата СУР растворяют, добавляя 80 мкл буфера VII, содержащего однопроцентный раствор тритон Х-100. Содержание белка измеряют по методу Лоури (с. 81) с модификацией, применяемой для определения белка в растворах тритона Х-100. В этом случае в раствор карбоната натрия, использующийся для определения, добавляют додецилсульфат натрия до конечной концентрации 0,3%. Далее определение ведется обычным способом Измеряют содержание белка в 20 мкл разведенного препарата СУР.

Измерение активности препарата СУР. Определение проводят в среде для измерения активности (16), содержащей 30 мкМ СВ и 5 мкМ Q%. В такой системе убихинон Q2 восстанавливается при участии СУР, а затем в неферментативной реакции практически мгновенно передает электроны на СВ:

сукцинат + Q2 ——->? фумарат + QaH2,

Q2H2 + 2CBOK ^Q + 2CB восст«

В ходе реакции Q2 постоянно регенерируется и его концентрация остается постоянной. Окисленная форма СВ окрашена в фиолетовый цвет и имеет максимум поглощения при 612 нм (коэффициент молярной экстинкции — 12 000 М-1 см-1). Восстановленная форма СВ бесцветна. Таким образом, реакцию, катализируемую СУР, можно измерить спектрофотометрически при 612 нм по падению оптической плотности раствора СВ. Перед измерением активности препарат СУР размораживают и разводят в 50 раз буфером V. Фермент инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин для активации сукцинатдегидрогеназы (с. 428), затем пробирку с ферментом помещают на лед.

В кювету спектрофотометра помещают 2 мл среды измерения активности. Включают прибор и выводят перо самописца в крайнее положение. Убедившись в том, что в отсутствие фермента не происходит изменения оптической плотности среды, добавляют 10 мкл* разведенного препарата СУР и регистрируют восстановление СВ, сопряженное с сукцинапубихинон-редуктазной реакцией. Добавляют 0,02 мл 20 мМ ТТА, при этом активность СУР резко тормозится. Рассчитывают каталитическую активность фермента в микромолях окисленного сукцина-та в минуту на 1 мг белка и степень торможения реакции ТТА.

Студентам предлагается самостоятельно:

1. Изучить зависимость скорости реакции от концентрации Q2. С этой целью в среду измерения активности добавляют в различных концентрациях Q2 (0; 0,2; 0,4; 0,8; 2 и 5 мкМ). Строят график зависимости скорости реакции от концентрации Q2 в прямых и двойных обратных координатах. Находят значение Утах и Кт СУР для Q2.

2. Изучить зависимость скорости реакции, катализируемой СУР, от концентрации ТТА и определить тип торможения реакции ингибитором. При выполнении этой части задачи из среды измерения активности исключают тритон Х-100.

ЛИТЕРАТУРА

1. Tushurashvili P. R., Gavrikova Е. V., Ledenev А N. et al. Studies on the succinate dehydrogenase system. Isolation and properties of the mitochondrial succinate—ubiquinone reductase//Biochim. Biophys. Acta. 1985. Vol. 809. P. 145.

2. Grivennikova V. G., Vinogradov A. D. Kinetics of ubiquinone reduction by the resolved succinate: ubiquinone reductase//Biochim. Biophys. Acta. 1982. Vol. 682. P. 491.

3 Гривенникова В Г, Виноградов А Д. Взаимодействие сукцинат убн-хинон-редуктазы митохондрий с теноилтрифторацетоном и карбоксином//Биохимия. 1985. Т. 50, № 3. С. 375.

4. Yu J., St ее k Т. L. Isolation and characterization of band 3, the predominant polypeptide of the human erythrocyte membrane//J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250. P. 9170.

5. Виноградов А. Д. Сукцинат: убихинон-редуктазный участок дыхательной це-пи//Биохимия. 1986. Т. 51, № 12. С. 1944.

5. ПОЛУЧЕНИЕ СУКЦИНАТ: ЦИТОХРОМ с-ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ (КОМПЛЕКС II + III)

Сукцинатщитохром с-оксидоредуктаза (SCR) катализирует окисление сукцината добавленным цитохромом с с образованием фумарата и восстановленного цитохрома с. В состав фермента входят компоненты сукцинат:убихинон-редуктазы (см. с. 423) и компоненты убихи-нонщитохром с-редуктазы (см. с. 429). Реакция практически полностью подавляется малонатом и оксалоацетатом (конкурентные ингибиторы дегидрирования сукцината), теноилтрифторацетоном и карбок-сином — ингибиторами восстановления убихинона сукцинатом и ан-тимицином А — ингибитором окисления убихинола цитохромом с. Получение препарата основано на «красно-зеленом» расщеплении дыхательной цепи детергентами при высокой ионной силе, в результате которого «красные» комплексы I, II и III оказываются солюбилизиро-ванными, а «зеленая» цитохромоксидаза (комплекс IV) остается нерастворимой. В результате дальнейшего фракционирования солюбилизированных комплексов удается получить э^к, состоящую по данным электрофореза из 9—10 полипептидов и обладающую высокой каталитической активностью.

Получение препарата SCR. Препарат Кейлина—Хартри (получение см. на с. 407) суспендируют в ОД М фосфатном буфере (натриевые соли), содержащем 0,2 мМ ЭДТА, рН 7,4. Содержание белка в суспензии доводят до 30 мг/мл. Стакан с суспензией помещают на лед и при хорошем перемешивании (магнитная мешалка) медленно добавл

страница 218
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
аренда тв
Рекомендуем фирму Ренесанс - лестница из нержавейки в бассейн - надежно и доступно!
кресло ch 300
складовки в москве стоимость

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)