химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

мпературе и хранят в эксикаторе при —20° С.

Реконструкция сукцинатдегидрогеназной активности. Частицы, дефицитные по коэнзиму Q (около 200 мг), суспендируют в стеклянном гомогенизаторе в небольшом объеме (1—2 мл) концентрированного пентанового экстракта (см. выше), содержащего около 40 мкмоль коэнзима Q на 1 мг белка частиц. Суспензию встряхивают в течение 30 мин при 0° С, а затем центрифугируют 10 мин при 1300g. Осадок осторожно ополаскивают 1 мл охлажденного пентана. Полученный препарат реконструированных частиц высушивают в роторном испарителе до полного удаления пентана. В день опыта частицы трех типов (лиофилизированные, экстрагированные пентаном и «реконструированные») гомогенизируют в 0,25 М сахарозе (концентрация белка 30—40 мг/мл), из каждого препарата отбирают по 0,05 мл суспензии для определения белка с бнуретовым реактивом.

Определение концентрации коэнзима Q в пентановом экстракте.

В кювету спектрофотометра помещают 2 мл этилового спирта и 40 мкл концентрированного пентанового экстракта, перемешивают и измеряют оптическую плотность раствора при 275 и 290 нм. Рассчитывают концентрацию коэнзима Q в экстракте (разность коэффициентов молярной экстинкции коэнзима Q при 275 и 290 нм равна 12 200 Mr1 см-!), а также количество коэнзима Q, экстрагированного из 1 мг частиц.

Измерение сукцинатоксидазных активностей полученных препаратов частиц. Для измерения сукцинатоксидазной активности пользуются полярографическим методом (с. 480). Кювету полярографа заполняют 2 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,6), добавляют 0,02 мл раствора цитохрома с. После погружения электродов включают регистрирующий прибор и устанавливают исходное значение электрического тока. Затем в кювету добавляют 0,05—0,1 мл лиофилизированного препарата Кейлина—Хартри и реакцию начинают добавлением 0,02 мл раствора 1 М сукцината калия. Аналогичным образом измеряют сук-цинатоксидазную активность препарата частиц, специфически лишенного коэнзима Q. Убедившись в том, что активность таких частиц существенно снижена, в кювету добавляют 100 мкМ ТМФД. Дыхание резко активируется, так как ТМФД обеспечивает перенос электронов от сукцинатдегидрогеназы непосредственно на цитохромоксидный участок дыхательной цепи. В следующей пробе проводят измерение сукцинатоксидазной активности реконструированного препарата частиц.

Рассчитывают скорости сукцинатоксидазных активностей трех препаратов СМЧ.

1. Ernster L., Lee I.-Y., NorHng B. et al. Studies with ubiquinone-depleted sub-mitochondrial particles. Essentiality of ubiquinone for the interaction of succinate dehydrogenase, NADH dehydrogenase, and cytochrome 6//Europ. J. Biochem. 1969. Vol. 9. P. 299.

2. Szarkowska L. The respiration of DPNH oxidase activity by coenzyme Q (ubiquinone)//Arch. Biochem. Biophys. 1969. Vol. 113. P. 519.

3. Ernster L., Glaser E., Norling B. Extraction and reincorporation of ubiquinone in submitochondrial particles//Methods in Enzymology/S. Fletsher, L. Packer eds. N. Y, 1978. Vol. LIII. P. 573.

4. Gutman M. Electron flux through the mitochondrial ubiquinone//Biochim. Biophys. Acta. 1980. Vol. 594. P. 53.

5. Trumpower B. L. New concept on the role of ubiquinone in the mitochondrial respiratory chain//J. Bioenerg. Biomembranes. 1981. Vol. 13. P. 1.

4. ПОЛУЧЕНИЕ СУКЦИНАТ: УБИХИНОН-ОКСИДОРЕДУКТАЗЫ (КОМПЛЕКС II)

Сукцинат:убихинон-редуктаза (СУР) катализирует окисление сукцината убихиноном. По данным электрофореза, в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия фермент состоит из 3—4 полипептидов. Субъединицы с молекулярными массами 70 000 и 28 000 Да представляют собой собственно сукцинатдегидрогеназу, в субстратсвязывающем центре которой происходит дегидрирование сукцината; низкомолекулярные компоненты комплекса II (м. м. ок. 15000 Да) придают сукцинатдегидрогеназе реактивность по отношению к убихинону, чувствительность к специфическим ингибиторам и, по-видимому, принимают участие в связывании фермента с мембраной. Выделение препарата СУР основано на экстракции фермента из мембраны с помощью неионного детергента тритона Х-100 и концентрировании препарата охлажденным ацетоном. Дальнейшее фракционирование сульфатом аммония и очистка на кальций-фосфатном геле позволяют получить фермент в высокоочищенном состоянии с каталитической активностью около 25 мкмоль окисленного сукцината в 1 мин на 1 мг белка.

Реактивы:

1. Реактивы для получения препарата Кейлина—Хартри (с. 407).

2. Сахароза — 0,25 М раствор.

3. Сукцинат натрия — 1 М раствор.

4. Холат натрия — 20%-ньгй раствор (рН 7,8).

5. Тритон Х-100 — 10%-ный раствор.

6. Ацетон.

7. Буфер I, содержащий 0,1 М фосфат натрия (рН 7,5) и 4 мМ ЭДТА (готовят в день выделения).

8. Буфер II, содержащий 4 М мочевину, 0,1 М фосфат натрия (рН 7,5) и 4 мМ ЭДТА.

9. Буфер III, содержащий 0,1 М фосфат натрия (рН 7,8), 20 мМ сукцинат натрия и 0,2 мМ ЭДТА.

10. Буфер IV, содержащий 20 мМ трис-сульфат (рН 7,5) 20 мМ сукцинат натрия и 0,2 мМ ЭДТА.

11. Буфер V, содержащий 20 мМ фосфат натрия (рН 7,8), 20 мМ.

страница 216
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
порталы для каминов из мдф недорого
табурет сигма виста
Кресло Bello HTS-102BN
плата управления для наружного блока general climate ce/cu-s36hr

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(28.02.2017)