химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

олбы, содержащие по 40 мл КО той же концентрации. Содержимое колб вновь перемешивают на холоде в течение 10 мин и центрифугируют повторно при тех же условиях для отделения митохондрий. Полученные осадки митохондрий суспендируют в 0,3—0,5 мл 0,3 М раствора сахарозы и используют в опытах.

Скорости потребления кислорода определяют полярографически (с. 480), используя в качестве субстратов сукцинат и глутамат. Ячейку полярографа заполняют 2 мл среды инкубации (см. выше), погружают электроды и в реакционную смесь вносят 0,08—0,10 мл густой суспензии митохондрий. Через 1 мин добавляют в смесь субстрат окисления (5 мМ) и через 1—2 мин вносят динитрофенол (50—100 мкМ). Каждую пробу повторяют дважды. Рассчитанные скорости дыхания представляют в виде таблицы:

Обработка препарата Скорость потребления кислорода, мкйтом 02/мнч/мг белка

сукцинат глутамат

—ДНФ +ДНФ -ДНФ +ДНФ

0,3 М сахароза (дважды) 0,15 М КС1 (дважды) 0,015 М КС1 0,15 М КО

Для препарата, промытого гипотоническим раствором КО, определяют зависимость скорости окисления сукцината от количества добавленного в среду инкубации цитохрома с: измеряют сукцинатокси-дазную активность, как описано выше, но в пробы добавляют цитохром с в концентрациях от 0 до 100 мкг/2 мл (5—6 точек). Полученные результаты представляют в виде графика.

Примечания. 1. Измерение скорости потребления кислорода можно проводить манометрически в той же среде инкубации. Заполнение сосудиков и технику работы см. на с. 10.

2. После получения исследуемых препаратов из каждой суспензии отбирают по 0,05 мл для определения белка с биуретовым реактивом (с. 483).

1. Ленинджер А. Митохондрия. М., 1968.

2. Jacobs Е. Е„ Sanadi D. R. The reversible removal of cytochrome с from mitochondria/A Biol. Chem. 1960. Vol. 235. P. 531.

3. ОТДЕЛЕНИЕ И РЕКОНСТРУКЦИЯ КОМПОНЕНТОВ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ (НА ПРИМЕРЕ КОЭНЗИМА Q)

Одним из компонентов дыхательной цепи митохондрий является коэнзим Q, или убихинон. Это соединение способно к редокс-превраще-ниям и присутствует в митохондриях в количествах, более чем на порядок превышающих содержание ферментов дыхательной цепи. Коэнзим Q акцептирует электроны от дегидрогеназ, локализованных во внутренней мембране митохондрий (сукцинат- и НАДН-дегидроге-назы), и передает их комплексу III (с. 415). Согласно хемиосмоти-ческой гипотезе Митчела, в процессе редокс-превращений коэнзим Q осуществляет векторный перенос протонов через мембрану в так называемом «Q-цикле». Реакция переноса электронов и протонов с участием коэнзима Q в комплексе III сопровождается высвобождением энергии, достаточной для синтеза одной молекулы АТФ.

В системе доказательств обязательного участия коэнзима в дыхательной цепи важную роль играют эксперименты по экстракции его из внутренней мембраны митохондрий различными органическими растворителями (циклогексаном, пентаном, ацетоном и др.). Такая обработка приводит к полному ингибированию переноса электронов от дегидрогеназ к молекулярному кислороду, но не сказывается на каталитической активности собственно дегидрогеназ, цитохромов и цитохро-моксидазы. Реконструкция коэнзима Q в состав препарата СМЧ, специфически лишенных убихинона, приводит к полному восстановлению утраченных функций.

В настоящей работе предлагается специфически удалить коэнзим Q из препарата субмитохондриальных частиц, убедиться в том, что при этом тормозится сукцинатоксидазная активность частиц и не происходит повреждения собственно сукцинатдегидрогеназы и цитохро-моксидазы, а затем реконструировать сукцинатдегидрогеназную активность добавлением к экстрагированным препаратам убихинона или его гомологов.

Реактивы и оборудование:

1. Реактивы для получения препарата Кейлина—Хартри (с. 407).

2. КО — 0,15 М раствор.

3. н-Пентан.

4. Сахароза — 0,25 М раствор.

5. Этиловый спирт (перегнанный).

6. Фосфат калия — 0,1 М раствор, рН 7,6.

7. Цитохром с — 2 мМ раствор.

8. Сукцинат калия — 1 М раствор.

9. ТМФД (тетраметил-я-фенилендиамин) — 0,01 М раствор.

10. Полярограф с набором кювет и микропипеток.

Выделяют препарат Кейлина—Хартри (см. с. 407). 100 мл препарата, суспендированного в 0,15 М КО в концентрации 20 мг/мл, замораживают в жидком азоте и высушивают в течение 18 ч на лиофиль-ной сушке до постоянного веса. Одну пятую часть (по весу) полученных лиофилизированных частиц помещают в эксикатор и хранят при —20° С. Оставшиеся частицы подвергают дальнейшей обработке.

Получение препарата, специфически лишенного коэнзим^а Q. Лио-филизированные частицы осторожно суспендируют с помощью гомогенизатора Поттера в 50 мл «-пентана, суспензию переносят в колбу со шлифом и встряхивают в течение 5 мин при 0° С, затем центрифугируют при 1300 g в течение 10 мин. Экстракцию пентаном Q повторяют 5 раз. Обычно таким способом удаляется 3—б мкмоль коэнзима Q из 1 мг СМЧ. Полученный экстракт коэнзима Q (250 мл) выпаривают на роторном испарителе до объема 2 мл. После экстракции частицы сушат в роторном испарителе до полного удаления пентана в течение 1 ч при комнатной те

страница 215
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
поломки холодильника liebherr
fc manchester city стикер
кресло chairman 668
автобус в аренду дешево

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.08.2017)