химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

М фосфатного буфера (рН 7,8) и хранят при 0° С. Препарат готовят накануне проведения опытов по реконструкции.

Реконструкция сукцинатоксидазы, В полярографической кювете объемом 2 мл составляют смесь, содержащую в 0,1 М фосфатном буфере (рН 7,8) 3—5 мг частиц белка, приготовленных, как указано выше, 100 мкг цитохрома с 10 мМ сукцинат. Электроды полярографа погружают в кювету и убеждаются в отсутствии потребления кислорода. Добавляют около 0,1 мл раствора фермента (сукцинатдегидрогеназы) и регистрируют поглощение кислорода. Образующаяся в процессе реконструкции сукцинатоксидаза обладает всеми свойствами нативной системы. Пользуясь приемами, описанными на с. 436, определяют чувствительность сукцинатоксидазы к ингибиторам транспорта электронов. В контрольных экспериментах убеждаются в отсутствии сукци-натоксидазной активности растворимого фермента.

Измерение сукцинатдегидрогеназной активности. В кювете спектрофотометра составляют смесь, состоящую из 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,8), 10 мМ сукцината, бычьего сывороточного альбумина (1 мг/мл) и 2 мМ феррицианида калия. Регистрируют оптическую плотность при 420 нм (коэффициент молярной экстинкции феррицианида равен 1-Ю3 М-1-см-1). В кювету добавляют раствор фермента (около 0,1 мл) и регистрируют сукцинат:феррицианид-редуктазную активность, отмечая показания спектрофотометра через каждые 30 с.

Студентам предлагается самостоятельно провести следующие работы:

1. Сравнение числа оборотов сукцинатдегидрогеназы в реконструированной системе и в изолированном состоянии.

2. Сравнение чувствительности нативной и растворимой сукцинатдегидрогеназы к ингибиторам дыхания.

3. Сравнение стабильности растворимого фермента в отношении реконструкции и реакции с искусственными акцепторами электронов (феррицианид).

ЛИТЕРАТУРА

1. King Т. Е. Preparation of succinate dehydrogenase and reconstitution of succinate oxidase//Methods in Enzymology/R. Estabrook, M. Pullman eds. N. Y.: L, 1976. Vol. 10. P. 322.

2. King Т. E. Reconstitution of the respiratory chain//Adv. in Enzymol. 1966. Vol. 28. P. 155.

3. Sin ger T. P., Kearney E. В., Kenney W. C. Succinate dehydrogenase// //Adv. in Enzymol. 1973. Vol. 37. P. 189.

4. Виноградов А. Д., Зимакова H. И. Сукцинатдегидрогеназа//Структура и функция ферментов. М., 1973. Вып. II. С. 3.

2. ОТДЕЛЕНИЕ И РЕКОНСТРУКЦИЯ КОМПОНЕНТОВ ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ (ЦИТОХРОМ с)

Перенос электронов и водорода от субстратов цикла трикарбоно-вых кислот осуществляется совокупностью ферментов и коферментов, локализованных в митохондриях. Большинство дыхательных переносчиков прочно связано с мембранами митохондрий и не отделяется от

них при обычных методах экстракции. Однако некоторые компоненты хорошо растворимы в водной среде и с помощью специальных приемов могут быть отделены от митохондрий. К ним относятся никотин-амидные коферменты и низкомолекулярный белок (м.м.= 13000 Да) — цитохром с. Считают, что цитохром с локализован в пространстве между внешней и внутренней мембраной митохондрий.

Существует несколько способов отделения цитохрома с от митохондрий. Принцип всех этих методов состоит в разрушении внешней мембраны митохондрий с помощью детергентов или гипотонической обработки и экстракции белка солевыми растворами. В настоящей задаче предлагается экстрагировать цитохром с из митохондрий, убедиться в снижении оксидазной активности экстрагированных препаратов и активировать дыхание добавлением цитохрома с. В качестве объекта исследования используются митохондрии печени крысы (получение см. выше). Схематически процесс отделения цитохрома с изображен на рис. 50.

межмембранное

Рис. 50. Схема отделения цитохрома с от митохондрий

Так как внутренняя мембрана митохондрий непроницаема для растворенных в матриксе веществ, гипотоническая обработка приводит к набуханию матрикса, что сопровождается разрывом внешней мембраны. При этом свободный цитохром с выходит в окружающую среду, а адсорбированный может быть легко удален экстракцией солевым раствором.

Реактивы:

1. Реактивы для выделения митохондрии печени крысы.

2. Сахароза — 0,3 М раствор.

3. КО — 0,15 и 0,015 М растворы.

^j.^Hxiui лалгт V,0 iVl paCTBCjp, ptl /,4.

5. Глутамат калия — 0,5 M раствор, рН 7,4.

6. 2,4-динитрофенол — 0,005 М раствор, рН 7,4.

7. Среда инкубации: 0,15 М сахароза, 0,075 М КС1, 0,01 М фосфат калия, рН 7,4.

8. Раствор цитохрома с — 1 мг/мл, готовится непосредственно перед опытом.

9. Реактивы для определения белка (с. 483).

Все растворы готовят на бидистиллированной воде.

Изолированные митохондрии печени крысы суспендируют в 3 мл 0,3 М раствора сахарозы. Три конические колбы заполняют 40 мл растворов: 0,3 М сахарозы (1), 0,15 М КС1 (2) и 0,015 М КО (3) — и в каждую добавляют по 1 мл густой суспензии митохондрий. Содержимое всех колб осторожно перемешивают в течение 10 мин при 0° С и затем переносят в три центрифужных стакана на 50 мл. Митохондрии отделяют центрифугированием при 10 000g, суспендируют в 0,5 мл 0,15 М раствора КО и переносят в три к

страница 214
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
адаптер для индукционных плит купить в спб
щит управления задвижками 018
кроссовки в саратове купить
wizardfrost.ru

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.05.2017)