химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

что при обработке субмитохондриальных фрагментов щелочью происходит необратимая потеря сукцинатоксидазной активности, тогда как цито-хромоксидазная активность в этих условиях остается практически неизменной. Эти эксперименты положили начало серии исследований, в результате которых были осуществлены выделение растворимой сукцинатдегидрогеназы и реконструкция сукцинатдегидрогеназной системы из дегидрогеназы и мембран, содержащих кофермент Q и цитохромы.

Сукцинатдегидрогеназа (КФ 1.3.99.1) принадлежит к типичным ферментам, прочно связанным с внутренней мембраной митохондрий. Сукцинатдегидрогеназа, способная к реконструкции, представляет собой белок (м. м. ок. 100 000 Да), содержащий в своем составе флави-надениндинуклеотид, ковалентно связанный с полипептидом, 8г-атомов негемового железа и 8г-моль сульфида, освобождающегося при подкис-лении среды. Белок катализирует окисление сукцината искусственными акцепторами электронов (феррицйанидом, феназинметосульфатом, тетраметил-п-фенилендиамином) со скоростями, соизмеримыми с сукци-натоксидазной реакцией. Дегидрогеназная активность фермента и его способность к реконструкции весьма неустойчивы. Будучи связана с мембранами, сукцинатдегидрогеназа стабильна во времени. Решающим фактором, определяющим высокую нестабильность растворимого ?фермента, является появление чувствительности к кислороду. Поэтому для получения способной к реконструкции сукцинатдегидрогеназы необходимо тщательно избегать контакта растворимого фермента с кислородом.

В настоящей работе предлагается получить частично очищенный препарат сукцинатдегидрогеназы и провести реконструкцию сукцина-токсидазы из растворимого фермента и мембран митохондрий, лишенных дегидрогеназной активности.

Реактивы:

1. Реактивы, необходимые для выделения препарата Кейлина— Хартри (с. 407).

2. Препарат Кейлина—Хартри, суспендированный в 50 мМ фос-фатно-боратном буфере (концентрация белка около 10 мг/мл).

3. Сукцинат калия — 0,6 М раствор, рН 7,8.

4. я-Бутанол, охлажденный до —15° С.

5. Фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 7,8.

6. Гель фосфата кальция (постаревший).

7. Уксусная кислота — 2 н. раствор.

8. Феррицианид калия — 2-Ю-2 М раствор.

9. Раствор цитохрома с — 1 мг/мл.

10. Раствор бычьего сывороточного альбумина — 10 мг/мл.

11.НС1 — 1 н. и 0,1 н. растворы.

12. КОН — 1 н. и 0,1 н. растворы.

Получение растворимой сукцинатдегидрогеназы. К 46 мл препарата Кейлина—Хартри (с. 407) добавляют 4 мл 0,6 М сукцината калия, суспензию деаэрируют продуванием азота в течение 15—20 мин. Колбу плотно закрывают и оставляют стоять на ночь при 0° С. На следующий день суспензию продувают азотом в течение 15—20 мин, доводят рН под слабым током азота до 9,35 (пользуются 1 н. КОН) и переносят в двухгорлую колбу, снабженную трубкой для пропускания азота (рис. 49).

Непосредственно перед работой проверяют рН-метр по стандартным буферным растворам. Включают магнитную мешалку, ток азота и из делительной воронки по каплям добавляют 10 мл деаэрированного и охлажденного до —15° С и-бутанола. По окончании делительную воронку закрывают и продолжают перемешивание в анаэробной атмосфере в течение 20—30 мин. Смесь переносят в два центрифужных стакана с крышками, уравновешивают, продувают азотом и центрифугируют 30 мин при 10 000 об/мин в центрифуге ЦВР при 0° С.

После центрифугирования смесь разделяется на 4 слоя: небольшой осадок, водный слой, плотный слой денатурированного белка и небольшой слой избытка нерастворившегося бутанола. Водный слой с помощью шприца переносят в мерный цилиндр, измеряют объем и переносят в химический стакан (под ток азота); рН раствора доводят деаэрированной 2 н. уксусной кислотой до 6,0. При отделении водНОГО СЛОЯ неООХОДИМО ТЩа!ельни ышдши, vW« Ui

грязненным другими фракциями.

К раствору добавляют гель фосфата кальция (деаэрированный) из расчета 4 мг сухого веса геля на 1 мл раствора и суспензию перемешивают под током азота 10 мин. Смесь центрифугируют в закрытых

S

стаканах 15 мин при 15 000 об/мин в центрифуге ЦБР. Осадок переносят в плотно закрывающуюся колбу, добавляют 20 мл ОД М фосфатного буфера, рН 7,8. В колбу помещают мешалку, продувают азотом, закрывают, хорошо перемешивают до полной гомогенности суспензии. Смесь центрифугируют 15 мин в закрытом стакане при 5000 об/мин в центрифуге ЦБР. Полученный желтый прозрачный супернатант представляет собой раствор частично очищенной сукцинатдегидроге-назы. Раствор оставляют под слабым током азота при 0° С и используют сразу после получения.

Приготовление субмитохондриальных частиц, лишенных сукцинат-дегидрогеназы. К 10 мл суспензии препарата Кейлина—Хартри осторожно при комнатной температуре добавляют 1 н. КОН до рН 9,3.

..г., .^^^«сшпиапии в течение 4t>— 60 мин, затем охлаждают до комнатной температуры и доводят рН до 7,8 осторожным добавлением 2 н. уксусной кислоты. Добавляют 25 мл 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,8) и центрифугируют при 0° С в центрифуге ЦВР при 18 000 об/мин в течение 30 мин. Осадок суспендируют в 5 мл 0,1

страница 213
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
аренда плазменных телевизоров
Фирма Ренессанс ограждение для лестницы из металла - цена ниже, качество выше!
стулья изо для офиса
велосипедов теплое хранение москва сао

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)