химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

).

Измерение цитохромоксидазной активности

В кювету полярографа, заполненную средой, содержащей 0,125 М сахарозу, 60 мМ КО, 10 мМ трис-НО, 0,1 мМ 2,4-динитрофенол и 40 мкМ цитохром с, вносят суспензию либо интактных митохондрий, либо митопластов, либо интактных митохондрий, разрушенных детергентом (конечное содержание белка в кювете полярографа —0,5— 1 мг/мл). Митохондрии, разрушенные детергентом, готовят, смешивая равные объемы густой суспензии митохондрий и 2%-ного раствора детергента твин-80. Смесь взбалтывают 2—3 мин и помещают на лед. Реакцию начинают добавлением нейтрализованной (рН 7,4) аскорбиновой кислоты (конечная концентрация 10 мМ). Регистрируют постоянное во времени поглощение кислорода и рассчитывают активность цитохромоксидазы в микроэлектронэквивалентах за 1 мин в расчете на 1 мг белка препарата.

При хорошо проведенном фракционировании удельные активности митопластов и митохондрий, разрушенных детергентом, примерно, равны, а удельная активность интактных митохондрий составляет не более 10% от этой величины. В препаратах внешних мембран, матрикса и межмембранного пространства обнаруживаются лишь следовые количества цитохромоксидазы.

Измерение активности ротенон-нечувствительной НАДН: цитохром Сфедуктазы

Кюветы спектрофотометра заполняют средой, содержащей: фосфатный буфер (рН 7,4), 1 мМ KCN, 1 мкМ ротенон, 1,5 мМ НхАДН, 10—20 мкМ цитохром с. Устанавливают длину волны 550 нм (точно!). Для этого кювету помещают в кюветное отделение, устанавливают длину волны по шкале прибора на отметке 550 нм и добавляют к среде нейтрализованный (рН 7,4) раствор аскорбиновой кислоты (конечная концентрация — 5—10 мМ). Цитохром с немедленно восстанавливается, и раствор меняет цвет от красновато-оранжевого до ярко-розового. Устанавливают шкалу длин волн на 550 нм по максимальному поглощению раствора восстановленного цитохрома с, при дальнейшей работе установку длин волн не меняют. Реакцию начинают внесением препаратов в кювету, содержащую окисленный цитохром с, и регистрируют увеличение поглощения при 550 нм. Рассчитывают удельную активность препаратов в микроэлектронэквивалентах за 1 мин в расчете на 1 мг белка. Коэффициент миллимолярной экстинкции для ци-тохрома с: Ar5fQ—a°*0==\q_ Активность фермента, характерного для внешней мембраны, определяют по разнице скоростей реакций в присутствии и в отсутствие ротенона.

Измерение активности малатдегидрогеназы

Кюветы спектрофотометра заполняют средой, содержащей 60 мМ КО, 20 мМ трис-НО и НАДН так, чтобы поглощение среды при 340 нм не превышало 1 ед. оптической плотности. К среде добавляют препарат исследуемой фракции (несколько десятков микролитров). При измерении активности суспензии препарат «растворяют» неионным детергентом тритон Х-100, так как неспецифическое рассеивание света в ультрафиолетовой части спектра весьма значительно. Реакцию начинают добавлением в опытную кювету свежеприготовленного нейтрализованного бикарбонатом раствора щавелевоуксусной кислоты — конечная концентрация в кювете 20 мкМ (малатдегидрогеназа тормозится избытком оксалоацетата\). Регистрируют начальные скорости реакций и рассчитывают удельную активность в микромолях восстановленного оксалоацетата (окисленного НАДН) за 1 мин на 1 мг белка.

Измерение активности аденилаткиназы (миокиназы)

Активность фермента легко может быть прослежена в сопряженной системе:

2АДФ Ваденилаткиьаз^^ дтф гексокиназа ^ глкжоз0_6-фосфаТ

1 АМФ глюкоза т

В присутствии избытка гексокиназы фосфорильный остаток одной из молекул АДФ оказывается перенесенным на глюкозу с образованием глюкозо-б-фосфата. В приведенном ниже простом методе регистрации аденилаткиназной активности использовано различие в ионизации субстратов и продуктов реакции. При рН 8,0 сопряженная система реакций может быть записана так:

2 АДФ"3^АТф-4 + АМФ-2 (аденилаткиназа). АТФ-4 + глюкоз а0^-АД Ф~3 + глюкозо-6-фосфат~2+ Н+. Сумма: АДФ-3-кАМФ~2 + глюкозо-6-фосфат-2 + Н+.

В слабозабуференной среде суммарная реакция сопровождается появлением одного иона Н+ на 1 моль превращенного АДФ. Небольшое закисление среды может быть зарегистрировано с помощью чувствительного регистрирующего рН-метра.

Кювету регистрирующего рН-метра заполняют средой, содержащей 2 мМ трис-HCl, 0,1 М КС1, 50 мкМ ЭДТА, 5 мМ MgCl2, 20 мМ глюкозу и 2 мМ АДФ (рН 8,0). Показания прибора калибруют, внося в кювету титрованный раствор НС1. Устанавливают чувствительность прибора так, чтобы внесение 100 мкМ НС1 (конечная концентрация) вызывало ~-90%-ный ответ пера потенциометра. Подбирают требуемое количество гексокиназы. Для этого в кювету вносят известное количество АТФ (50 мкМ) и добавляют такое количество гексокиназы, которое обеспечивает закисление среды с ti/2~5 с.

Заполнив опытную кювету указанным выше раствором, добавляют требуемое количество гексокиназы и реакцию начинают внесением исследуемого препарата (митохондрии, митопласты, супернатант 52, внешние мембраны). Реакцию регистрируют 1—2 мин, чувствительность прибора калибруют внесением титрованного ра

страница 211
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
головной микрофон на прокат
Рекомендуем компанию Ренесанс - лестницы складные чердачные - цена ниже, качество выше!
стул самба купить
боксы ячейки для хранения

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)