химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

мембраной митохондрий. Формирование везикул под действием ультразвука происходит таким образом, что обращенная в матрикс интактных митохондрий поверхность внутренней мембраны становится наружной, обращенной в окружающую среду поверхностью мембраны СМЧ. Такое изменение ориентации мембраны делает СМЧ весьма удобным, а иногда и единственно пригодным объектом для изучения механизма реакций, протекание которых в интактных митохондриях опосредовано (и может контролироваться) трансмембранным переносом веществ. Препараты СМЧ широко используются, в частности, при изучении АТФ-синтетазного комплекса, активный центр которого в этом объекте экспонирован в окружающую среду и свободно доступен для субстратов и продуктов катализируемой им реакции.

Мембрана СМЧ, процедура получения которых описана ниже, характеризуется высокой проницаемостью для ионов Н+. В связи с этим

такие препараты могут быть использованы для изучения аэробного синтеза АТФ только после специальной обработки. Вместе с тем эти ^препараты могут быть успешно использованы для кинетического изучения АТФ-гидролазной реакции.

Выделение митохондрий сердца быка

Реактивы и оборудование:

1. Среда для промывания ткани, содержащая 0,9% КС1, 1 мМ ЗДТА, 5 мМ трис-HCl (рН 7,8) — 10 л.

2. Трис — 1 М раствор.

3. Среда выделения митохондрий, содержащая 0,25 М сахарозу, 15 мМ ЭДТА, 10 мМ трис-HCl (рН 7,5) — 5 л.

4. Сахароза — 0,25 М раствор.

5. Стеклянный гомогенизатор с тефлоновым пестиком.

Примечание. Среда промывания может быть приготовлена на дистиллированной воде. Все процедуры по выделению проводят при температуре 0—4° С.

Препарат получают из двух бычьих сердец, взятых непосредственно после забоя животных (транспортировка в сумке-холодильнике со льдом, приготовленным из дистиллированной воды).

Очищенные от жира и соединительной ткани мышцы двух сердец пропускают через мясорубку. Измельченную ткань (800 г) несколько раз промывают средой № 1 в стакане обьемом 2 л. При промывании необходимо поддерживать рН суспензии на уровне 7,4 раствором 1 М триса (контроль по индикаторной бумаге). Каждый раз промывные воды отфильтровывают через 4 слоя марли.

Когда промывные воды приобретают слабо-розовую окраску, мышечную массу ополаскивают средой выделения и отфильтровывают в последний раз. Затем ее помещают в пластмассовое ведро объемом 4 л, добавляют среду выделения до объема 3500 мл и гомогенизируют ножевым гомогенизатором 3—4 раза по одной минуте с интервалами 30 с; рН гомогената проверяют на рН-метре и в случае необходимости доводят его 1 М раствором триса до 7,4. Гомогенат центрифугируют 15 мин при 1400g на центрифуге К-70 (2800 об/мин). Предварительно проверив рН (7,4—7,5), полученный супернатант центрифугируют далее 15 мин при 11000 g на центрифуге «Весктап» (ротор JA-I4, 9000 об/мин). Супернатант вместе с верхним рыхлым слоем осадка сливают, плотный осадок митохондрий суспендируют в 0,25 М сахарозе при помощи стеклянного гомогенизатора с тефлоновым пестиком и переосаждают в тех же условиях. Полученные митохондрии суспендируют в 0,25 М сахарозе в гомогенизаторе до конечной концентрации белка 50—60 мг/мл (объем 15—20 мл), замораживают при —20° С и используют в дальнейшем для получения субмитохондриальных частиц.

Получение субмитохондриальных частиц

Реактивы:

1. Среда для суспендирования митохондрий, содержащая 0,15 М сахарозу, 1 мМ ЭДТА (рН 7,5) — 100 мл.

2. Раствор 1 н. NH4OH (готовят 10-кратным разведением концентрированного аммиака).

Л (\Г\

3. Среда для переосаждения СМЧ: 0,25 М КС!, 75 мМ сахароза,, 30 мМ трис-504, 2 мМ ЭДТА, рН 8,0.

4. Сахароза — 0,25 М раствор.

Суспензию митохондрий размораживают в бане с водой комнатной температуры и суспендируют в среде № 1 до концентрации белка 20 мг/мл. Значение рН суспензии (стаканчик с суспензией находится в сосуде со льдом) доводят 1 н. раствором NH4OH до 9,1—9,2. Суспензию обрабатывают на ультразвуковом дезинтеграторе MSE-100 в течение 2 мин (по 1 мин с перерывом в 30 с) при максимальной мощности и постоянном тщательном охлаждении. После этого ее центрифугируют 10 мин при 26000g на центрифуге «Весктап» (ротор JA-20, 15 000 об/мин) при 0—4° С. Супернатант сливают через марлю в центрифужные стаканы и при той же температуре центрифугируют 20 мин при 200000g на УЦП-75 (ротор 75, 47 000 об/мин). Осадок СМЧ суспендируют в среде для переосаждения и переосаждают в гех же условиях. Полученные СМЧ гомогенизируют в минимальном объеме 0,25 М сахарозы с помощью стеклянного гомогенизатора с тефло-новым пестиком, разливают на небольшие порции и замораживают в жидком азоте в полиэтиленовых пробирках.

Примечание. Выход СМЧ из митохондрий ~ 20% (по белку) ? АТФазная активность — 1—1,5 мкмоль/мин на 1 мг белка. Препарат может храниться в жидком азоте в течение нескольких месяцев без потери активности.

ЛИТЕРАТУРА

1. Crane F. L., Glenn J. L., Green D. E. Studies on the electron transfer system. IV. The electron transfer particles//Biochim. Biophys. Acta. 1956. Vol. 22. P 475.

2. Low H., Va 11 i n

страница 209
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Выключатель Webasto
крэйзи линзы цветные москва
лайтбоксы на крышу автомобиля
мифепристон мизопростол цена

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(08.12.2016)