химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ds in Enzymology/R. Estabrook, M. Pullmam eds. Acad. Press. N. Y.; L., 1967. Vol. 10.

P. 94.

II. ПОЛУЧЕНИЕ СУБМИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ФРАГМЬНШВ И ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ МИТОХОНДРИЙ

1. ПОЛУЧЕНИЕ СУБМИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ФРАГМЕНТОВ (ПРЕПАРАТ КЕЙЛИНА—ХАРТРИ)

Хотя интактные митохондрии представляют собой удобный объект для изучения механизмов биоэнергетики, для решения ряда задач используют более простые системы — субмитохондриальные фрагменты. К числу таких задач относится изучение переноса электронов в дыхательной цепи, локализованной во внутренней мембране митохондрий. Существование системы мембран, барьеров проницаемости, системы переноса энергии и др. очень осложняет однозначную интерпретацию кинетики окислительно-восстановительных реакций в интактных митохондриях. В связи с этим были разработаны методы получения более простых препаратов субмитохондриальных частиц. Последние могут быть получены при действии на митохондрии либо детергентов, либо сильных механических воздействий (ультразвук, растирание с песком и т. д.). К числу различных субмитохондриальных фрагментов относится так называемый препарат Кейлина—Хартри, представляющий собой фрагменты внутренней мембраны митохондрий, почти лишенные ферментов цикла Кребса. Препарат имеет полный набор дыхательных переносчиков, обладает высокими активностями НАД-Н и сукцинатокси-дазы, стабилен при хранении.

Принцип получения препарата Кейлина—Хартри состоит в экстракции измельченной ткани солевыми буферными растворами, разрушении ее с помощью абразивных материалов и фракционировании центрифугированием.

Реактивы:

1. Фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 7,4.

2. Фосфатный буфер — 0,2 М раствор, рН 7,4.

3. Фосфатно-боратный буфер, рН 7,4; готовят смещиванием равных объемов растворов: 0,15 М Н3ВОз и 0,15 М Na2HP04.

4. НС1 — 1 н. и 0,1 н. растворы.

5. КОН — 1 н. и 0,1 н. растворы.

Фосфатный буфер готовят на дистиллированной, а фосфатно-боратный — на бидистиллированной воде.

Препарат получают из сердечной мышцы быка. Сердце очищают от жира, сосудов и соединительной ткани, нарезают кусочками размером 4X4 см и пропускают через мясорубку. Мышечную массу помещают в большой стакан или эмалированную кастрюлю, заливают 10 л холодной водопроводной воды и сильно перемешивают пропеллерной мешалкой в течение 20 мин. После перемешивания воду сливают, оставшуюся массу фильтруют через 4 слоя марли и тщательно отжимают. Описанную процедуру повторяют 5—6 раз. После промывания отжатая мышечная масса имеет слабый желто-розовый цвет. Все дальнейшие процедуры проводят в холодной комнате. Массу заливают 10 л 0,1 М фосфатного буфера, охлажденного до 4° С, и оставляют на 2 ч при непрерывном перемешивании. Экстракт сливают, оставшуюся массу дважды промывают, беря каждый раз по 5 л дистиллированной воды, и сильно отжимают (для этой цели лучше использовать ручной пресс).

лирши ui*dibiH препарат помещают в большую фарфоровую ступку, добавляют 100 мл 0,02 М фосфатного буфера (рН 7,4) и 100 г кварцевого песка для растирания. Смесь растирают пестиком в течение 1,5 ч до получения гомогенной сметанообразной массы. К ней добавляют 250 мл 0,02 М фосфатного буфера и смесь тщательно размешивают.

Полученный препарат центрифугируют при охлаждении (стаканы на 0,5 л) в течение 30 мин при 2500 об/мин. Супернатант осторожно сливают в большой стакан, не взмучивая осадок, разливают в центрифужные стаканы на 50 мл и центрифугируют при 40 000 g (ЦБР—1) в течение 1,5 ч при 1—2° С. Почти прозрачный супернатант сливают. К осадкам добавляют по 2 мл фосфатно-боратного буфера. Смесь суспендируют в стеклянном гомогенизаторе при малой скорости вращения пестика и разливают в пробирки по 3 мл.

Полученные препараты можно хранить при 0° С в течение нескольких дней без заметного снижения сукцинатоксидазной активности.

Примечание. 1. Препарат Кейлина—Хартри можно получать как из свежего, только что взятого материала, так и из замороженной мышцы. В последнем случае НАДН-оксидазная активность полученных препаратов очень невелика, тогда как на сукцинатоксидазную активность замораживание ткани не оказывает существенного влияния. 2. При экстракции ткани фосфатным буфером происходит вымывание не только ферментов цикла Кребса, но и цитохрома с, так что высокие оксидазные активности препаратов могут быть получены только при добавлении цитохрома с в среду инкубации.

3. Процедура получения может быть прервана на стадии экстракции фосфатным буфером. В этом случае смесь оставляют перемешиваться на ночь.

ЛИТЕРАТУРА

King Т. Е. Reconstitution of respiratory chain enzyme system. IV. «Cross-reconstitu-tion» of sarcosomal succinate oxidase from soluble succunic dehydrogenase of different species//J. Biol. Chem. 1961. Vol. 236. P. 2342.

2. ПОЛУЧЕНИЕ СУБМИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ЧАСТИЦ ИЗ СЕРДЦА БЫКА

Один из методов получения субмитохондриальных частиц (СМЧ) основан на обработке предварительно выделенных интактных митохондрий ультразвуком. Полученные таким способом СМЧ представляют собой замкнутые везикулы, образованные внутренней

страница 208
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
учеба дистанционно в москве холодильшик
кровать детская 190*120 в минске
где купить цифры на самоклейке
ремонт холодильников на дому ока

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(29.05.2017)