химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ого фосфорилирования заведомо превалируют над гликолизом и субстратным фосфорилированием в цикле трикарбоновых кислот. Таким образом, настоящий раздел практикума фактически посвящен описанию экспериментальных подходов к изучению метаболизма митохондрий — внутриклеточных органелл, ответственных за дыхательное фосфорилирование.

В качестве объекта исследования во всех задачах используются либо митохондрии из различных тканей, либо их фрагменты, обладающие соответствующим набором ферментативных активностей. Получение интактных митохондрий или их фрагментов, а также выделение некоторых митохондриальных ферментов само по себе представляет небольшое, но требующее тщательности и опыта самостоятельное препаративное исследование. Поэтому получение этих препаратов приведено в «Практикуме» в виде отдельных работ.

Современная биоэнергетика использует весьма разнообразный набор сложных физико-химических методов (электронного парамагнитного резонанса, дифференциальной и двухволновой спектрофотометрии, методов быстрой кинетики и др.), пока недоступный для работы в студенческом практикуме. Приведенные задачи охватывают только минимум экспериментальных приемов и технических средств, свободное владение которыми необходимо любому начинающему научному работнику — биохимику.

I. ПОЛУЧЕНИЕ ИНТАКТНЫХ МИТОХОНДРИЙ ИЗ РАЗЛИЧНЫХ ТКАНЕЙ

Общие принципы работы при выделении митохондрий. Выделение

митохондрий из различных тканей (скелетных мышц, сердца, печени) требует соблюдения следующих условий. Во-первых, следует тщательно измельчать ткань, почти до гомогенного состояния, так как от этого сильно зависит выход митохондрий. Ткань измельчают ножницами (на чашке Петри) или с помощью мясорубки Латапи, в которой ткань продавливается через отверстия диаметром 1,0—1,5 мм. После этого ее гомогенизируют до получения однородной кашицы. Во-вторых, необходимо внимательно контролировать температурный режим на всех этапах выделения (0—4° С), так как при его нарушении митохондрии утрачивают ряд своих свойств. Поэтому все процедуры проводят в холодной комнате; все растворы и инструменты должны быть хорошо охлаждены. При охлаждении гомогенизатора пестик необходимо вынуть из стакана, так как стекло и тефлон имеют различные коэффициенты температурного расширения. Структура митохондрий очень чувствительна к замораживанию, поэтому нельзя допускать даже незначительного промерзания растворов во время центрифугирования. В-третьих, выделение митохондрий надо проводить по возможности быстро и использовать их в работе сразу же.

I. ВЫДЕЛЕНИЕ МИТОХОНДРИИ СКЕЛЕТНЫХ МЫШЦ

Реактивы:

1. Среда выделения: 0,1 М КО, 0,05 М трис-HCl (рН 7,4), 0,001 М MgCb. Среду выделения готовят в день опыта. Для этого смешивают концентрированные растворы КО и MgCl2, а трис-HCl добавляют в виде навески. Объем раствора доводят до 180 мл, устанавливают рН добавлением сначала 2 н., а затем 1 н. и 0,1 н. НС1, после этого окончательно доводят объем до 200 мл. КО и MgCl2 — химически чистые, перекристаллизованные. Концентрацию основного раствора MgCl2 определяют титрованием ЭДТА с эриохромом черным Т (с. 484).

2. Сывороточный альбумин — 2%-ный раствор.

3. НО — 2 н. и 0,1 н. растворы (для доведения рН среды выделения) .

4. КОН — 2 н. и 0,1 н. растворы (для доведения рН среды выделения).

Все растворы готовят на бидистиллированной воде.

В три стакана (объемом 100, 50 и 50 мл) наливают по 30 мл среды выделения, охлажденной до 0°С. Среда гомогенизации должна содержать соли, так как в растворе сахарозы или других неэлектролитов миофибриллы желатинируются и плохо разрушаются. Первый стакан (на 100 мл) взвешивают, второй (на 50 мл) помещают в замораживающий холодильник, чтобы в жидкости появились кристаллы льда.

У только что декапитированной крысы быстро вырезают мышцы задних конечностей, стараясь их не повредить, и помещают их в стакан с переохлажденной средой. Через 5 мин мышцы переносят на чашку Петри, освобождают от жира, сухожилий и нервов и помещают в третий стакан (50 мл). После очистки всех кусочков ткани их обсушивают фильтровальной бумагой и тщательно измельчают. Кашицу переносят в первый стакан* и определяют чистый вес ткани. Добавляют среду выделения в таком количестве, чтобы общий объем ее в 4 раза превышал объем ткани. Смесь измельчают в гомогенизаторе 1 мин, поднимая и опуская пестик. Гомогенат переносят в центрифужные стаканы и центрифугируют при 0° С 7 мин при 600 g. Осадок, содержащий обломки клеток, ядра и миофибриллы, отбрасывают, надосадочную жидкость центрифугируют 5 мин при 2000 g для более полного удаления миофибрилл. Полученный супернатант фильтруют через 4 слоя марли и центрифугируют 10 мин при 9000 g.

Поверхность полученного осадка митохондрий дважды ополаскивают 2 мл среды выделения для удаления верхнего рыхлого слоя, содержащего примесь саркоплазматического ретикулума. Внутренние •стенки стакана осторожно подсушивают фильтровальной бумагой. К осадку добавляют среду выделения из расчета 0,05 мл на 2 г ткани для полярографических исследований или 0

страница 206
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
проводы в аэропорт внуково
купить asics дешево
barazzoni сковорода
электропривод клапана регулирующего asto4.s

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(27.03.2017)