химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ветственно следующие количества раствора ПХМБ: 0,00 мл; 0,02 мл; 0,04 мл; 0,06 мл; 0,07 мл; 0,075 мл; 0,08 мл; 0,085 мл; 0,090 мл; 0,10 мл, тщательно перемешивая взбалтыванием каждую пробу сразу же после добавления раствора ПХМБ. В две последние пробы ничего не добавляют. Незначительными различиями в объемах проб вследствие добавления различных количеств ПХМБ пренебрегают при последующих расчетах. По истечении 10 мин от начала добавления ПХМБ во все пробы (кроме двух последних) приливают (также с 30-секундными интервалами) по 0,6 мл раствора АТФ. Время инкубации миозина с АТФ должно составлять 20—30 мин. По окончании инкубации во все пробы (включая две последние) добавляют по 0,3 мл 20%-ной трихлоруксусной кислоты. В две последние пробы после ее добавления приливают по 0,6 мл раствора АТФ. Эти пробы будут служить контролем на содержание неорганического фосфата в реактивах и на фон за счет расщепления АТФ в кислой среде.

Осадок белка удаляют фильтрованием. На определение неорганического фосфата из каждой пробы после фильтрования берут по 0,8 мл ТХУ-фильтрата, добавляют по 0,1 мл неразведенного раствора эйконогена, 0,3 мл молибденового реактива и по 1,3 мл воды. Через 10— 15 мин выдерживания на водяной бане (или в термостате) при 37— 40 °С пробы колориметрируют. Учитывая нестабильность стандартной кривой при определении неорганического фосфата методом Фиске— Суббароу, желательно одновременно с опытными пробами ставить 3— 5 проб с разными количествами стандартного раствора неорганического фосфата.

Активность миозина в пробах рассчитывают в микромолях неорганического фосфата за 1 мин на ^ мг белка. Проводят сопоставление кривой титрования сульфгидрильных групп миозина ПХМБ и кривой изменения его активности при разной степени модификации. Отмечают полную потерю активности ферментом при 100 %-ном блокировании SH-групп, а также 1,5—3-кратную активацию АТФазы при блокировании до 50% SH-rpynn.

Сопоставление влияния органических (ПХМБ) и неорганических (Ag+, Hg2+) реагентов на SH-группы при использовании их для модификации миозиновой АТФазы

Реактивы:

1. —5: см. с. 398.

6. HgCl2 — 5-10-4 М раствор.

7. AgCl2 — 5- Ю-4 М раствор.

Постановка эксперимента полностью идентична вышеописанной, при этом сопоставляют действие ПХМБ, ионов серебра (5-10~4 М р-г> AgCl2) и ионов двухвалентной ртути (5-Ю-4 М раствор HgCb) на АТФазную активность миозина. Убеждаются в том, что: а) неорганические SH-реагенты не вызывают, в отличие от ПХМБ, активации миозиновой АТФазы (т. е. активация под действием ПХМБ, по-видимому ^ обусловлена взаимодействием его слабополярной органической части с гидрофобными группами белка); б) для полного блокирования АТФаз-ной активности требуется такое же количество ионов серебра, как и количество ПХМБ, но вдвое меньшее количество двухвалентной ртути„ что говорит в пользу попарно сближенного расположения сульфгидрильных групп в молекуле миозина.

Роль гидрофобных взаимодействий в АТФазной активности миозина

Реактивы:

1. Толуол.

2. Октанол.

3. Динитрофенол — 100 мМ раствор 10.

4. Среда инкубации: 0,5 М КС1, 0,02—0,04 мМ трис-HCl, 1—2Х ХЮ-2 М СаС12, 5—7 мг/мл АТФ, рН среды инкубации доводится до 7,6 после смешивания всех компонентов.

5. Остальные растворы: см. с. 393.

Для определения АТФазной активности к 1 мл среды инкубации добавляется 0,1 мл раствора миозина в 0,5 М КО, содержащего около 10 мг белка в 1 мл. По завершении инкубации (обычно 10—15 мин) реакцию останавливают добавлением 1 мл 5%-ной трихлоруксусной кислоты и в ТХУ-фильтрате определяют неорганический фосфат методом Фиске—Суббароу (с. 34).

Желательно ставить по три параллельные пробы для каждого варианта постановки эксперимента, например:

1) три пробы, в которых будет определяться содержание неорганического фосфата в реактивах (контроль); здесь в среду инкубации до добавления фермента приливают ТХУ либо вместо раствора фермента добавляют 0,1 мл воды (препарат миозина не содержит неорганического фосфата);

2) три пробы, в которых АТФазная активность определяется без каких-либо добавок, т. е. в отсутствие модификаторов;

3) три пробы, в каждую из которых добавлено по одной капле толуола, — до добавления раствора фермента (при этом образуется грубо-дисперсная эмульсия);

4) три пробы, в которые до добавления раствора фермента в среду инкубации добавляется по одной капле октанола (здесь также образуется грубодисперсная эмульсия);

5) три пробы, в которых среда инкубации содержит 20 мМ динитро-фенола (ДНФ).

10 При приготовлении раствора для лучшего растворения динитрофенола необходимо добавить несколько капель 2 н. КОН, а затем рН раствора осторожно довести до значений, близких к нейтральным.

В результате эксперимента удостоверяются в том, что добавление в среду инкубации толуола, октанола или динитрофенола приводит к возрастанию АТФазной активности миозина, несмотря на то, что в пробах выпадают хлопья белка, что визуально воспринимается как денатурация. Наименьшее активирующее действие проявляется в случае толуола

страница 204
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
колонки в аренду москва
Рекомендуем фирму Ренесанс - лестницы профи и хобби официальный сайт - всегда надежно, оперативно и качественно!
кресло 9906
аренда теплого склада в москве на время ремонта

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)