химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

й воды (2—3 смены). Следует помнить, что все операции по выделению и очистке проводятся на холоде. Раствор фермента в бидистиллированной воде хранят в холодильнике и используют в течение 2—3 нед.

Получение субфрагмента-1 (без ДТНБ-легких цепей) папаиновым перевариванием миозина

Реактивы:

1. NH4CH3COO — 0,2 М раствор с 2 мМ ЭДТА. рН 7,0.

2. Папаин.

3. Цистеин — 25 мМ раствор, рН 6,5.

4. СН21СООН — 10 мМ раствор, рН 7,0

5. Трис-HCl буфер (рН 7,5) — 30 мМ раствор.

6. ДЭАЭ-целлюлоза (ДЭАЭ-52, ватман).

7. Трис-HCl буфер — 30 мМ (рН 7,5), приготовленный на 90 мМ КО.

8. ЭДТА — 5 мМ раствор. '

Подготовка миозина и папаина. Папаиновый субфрагмент-1 миозина получают, используя в качестве протеазы папаин. Перед проведением протеолиза необходима специальная подготовка раствора миозина, которая заключается в диализе его (20 мг/мл в 0,5 М Kt31) в течение ночи против 30-кратного объема 0,2 М ацетата аммония (рН 7,0), содержащего 2 мМ ЭДТА. Препарат папаина непосредственно перед использованием необходимо активировать в течение 1 ч путем инкубации при 37 °С в среде, содержащей 2 мг/мл папаина и 25 мМ цистеина, рН 6,5.

Переваривание миозина папаином. Переваривание миозина папа-ином проводят в течение 30 мин при комнатной температуре при весовом соотношении папаина к миозину 1:200. Реакцию протеолиза останавливают добавлением отнейтрализованного КОН раствора монойод-уксусной кислоты (рН 7,0) до конечной концентрации 1 мМ. Папаиновый гидролизат центрифугируют при 105 000 g в течение 90 мин. Супернатант, представляющий собой раствор головок миозина, диализуют в течение ночи против десятикратного объема 30 мМ трис-HCl буфера (рН 7,5), содержащего 1 мМ монойодуксусной кислоты. Диализат наносят на колонку (2x11 см) с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЭАЭ-52, ватман), уравновешенную 30 мМ трис-HCl буфером, рН 7,5. После нанесения белка колонку промывают двумя объемами этого же буфера. Белок элюируют 90 мМ КО в 30 мМ трис-HCl буфере, рН 7,5. Фракции белка диализуют в течение 1 ч против 5 мМ ЭДТА, затем в течение ночи против бидистиллированной воды (2—3 смены). Препарат субфрагмента-1 с концентрацией белка 2—3 мг/мл хранят в течение 10—15 дней.

Получение субфрагмента-1 химотрипсиновым перевариванием миозина

Реактивы:

1. КО — 0,5 М раствор.

2. Na-фосфатный буфер — 20 мМ (рН 7,0), содержащий 0,12 М NaCl и 1 мМ ЭДТА.

3. а-химотрипсин.

4. Раствор фенилметансульфонилхлорида в этиловом спирте — 100 мМ

5. Трис-HCl буфер — 50 мМ, рН 7,0.

6. ЭДТА — 5 мМ раствор.

Раствор миозина (20 мг/мл) в 0,5 М КО диализуют в течение ночи против 25-кратного объема 20 мМ натрий-фосфатного буфера (рН 7,0), содержащего 0,12 М NaCl и 1 мМ ЭДТА. К раствору миозина добавляют водный раствор а-химотрипсина до конечной концентрации 0,05 мг/мл. Через 15 мин реакцию протеолиза останавливают добавлением 100 мМ раствора фенилметансульфонилхлорида в этиловом спирте до конечной концентрации 2,5-1О"4 М для ингибирования реакции протеолиза. От избытка ингибитора освобождаются диализом против 50 мМ трис-НО буфера, рН 7,0 (2—3 смены). Химотрипсиновый гидролизат центрифугируют при 45 000 g в течение 30 мин для отделения нерастворимых в воде легкого меромиозина и непереваренного миозина. Супернатант диализуют в течение 1 ч против 5 мМ ЭДТА, затем в течение ночи против бидистиллированной воды (2—3 смены). Препарат головок (субфрагмента-1) с концентрацией 4—5 мг/мл хранят при 4°С и используют в течение 10—15 дней. Из 1 г миозина получали 150—200 мг субфрагмента-1.

Электрофоретический анализ препаратов миозина и его протеолитических фрагментов с АТФазной активностью

Электрофорез проводят в пластинах полиакриламидного геля в присутствии додецилсульфата натрия на приборе для электрофореза с вертикальным расположением пластин производства объединения «Хийу Калур» (ЭССР). Основные и рабочие растворы готовят по методике Лэммли (с. 121).

Для построения калибровочной кривой при определении молекулярных масс используют белки-стандарты: тропонин С (18 000 Да), тропонин I (24 000 Да), тропонин Т (38 000 Да), яичный альбумин (42 000 Да) и бычий сывороточный альбумин (68 000 Да), а также стандартный набор для определения молекулярной массы белков. При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия препарат миозина дает расположенную почти у старта интенсивную полосу тяжелых цепей с м. м. ок. 20 000 Да и три слабые, но отчетливые полоски легких цепей с м. м. ок. 20 000 Да для самой «тяжелой» из них и около 16 000 Да — для самой легкой. Подвижность этих полос в описанных выше условиях высока, поэтому при достаточно большой продолжительности электрофореза эти полоски могут обнаружиться почти у фронта красителя (бромфенолового синего).

Препарат субфрагмента-1, полученного методом химотрипсинового протеолиза, при электрофорезе в ДСН дает полосу фрагмента тяжелых цепей с м. м. 96 000 Да и две полосы легких цепей — с м. м. 20 000— 21 000 Да и 16 000—17 000 Да. Легкие цепи с м. м. 18 000—19 000 Да полностью деградируют при химотрипсиново

страница 202
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
рейтинг курсов эксель
KNSneva.ru - предлагает медиаплеер купить - от товаров до интеграции в Санкт-Петербурге!
ландшафтный дизайнер курсы
лпджи обучение москва

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(06.12.2016)