химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ионной смеси, которые приливают к 1 мл охлажденного 5%-ного раствора СОзСООН. В фильтратах определяют прирост неорганического фосфата.

Определение неорганического фосфата. К 1 мл фильтра добавляют 1,0 мл воды, 0,4 мл молибденового реактива и 0,1 мл. рабочего раствора эйконогена, хорошо перемешивают и оставляют на 10 мин в термостате при 37 °С. Раствор быстро охлаждают и тотчас же колори-метрируют на ФЭКе. Одновременно строят калибровочный график по стандартным растворам фосфата, содержащим от 0,2 до 2 мкмоль фосфата в пробе (с. 34). По разности содержания неорганического фосфата в пробах после ферментативного гидролиза и в контрольной пробе рассчитывают количество фосфата, образовавшегося в процессе ферментативного расщепления АТФ. Затем рассчитывают активность миозина — в мкмолях превращенного субстрата за 1 мин на 1 мг белка.

Получение препарата тяжелого меромиозина

Метод получения тяжелого меромиозина (ТММ) основан на частичном протеолитическом расщеплении миозина под действием трипсина. Отделение тяжелого меромиозина от миозина и от фрагмента хвостовой части миозиновой молекулы (легкого меромиозина) основано на его хорошей растворимости при низкой ионной силе, когда легкий меромиозин и миозин выпадают в осадок. Для последующей очистки полученного препарата можно воспользоваться колоночной хроматографией или высаливанием сернокислым аммонием.

Реактивы:

1. Имидазольный буфер — 30—50 мМ раствор, рН 7,6, приготовленный на 0,5 М КО. 2 Трипсин.

3. Ингибитор трипсина из соевых бобов.

4. Насыщенный раствор сернокислого аммония, перекристаллизованного с ЭДТА (довести рН раствора до нейтрального или слабощелочного значения).

5. ВаС12 — насыщенный раствор.

6. Трис-НО буфер — 0,05 М раствор (рН 7,9).

7. КО — 0,5 М раствор.

8. ЭДТА — 5 мМ раствор.

9. ДЭАЭ-целлюлоза (ДЭАЭ-52, ватман).

9 Чтобы раствор миозина сильно не разводить, желательно, чтобы объемы растворов трипсина и ингибитора трипсина не превышали 0,1—0,2 объема миозина.

Переваривание миозина и получение раствора тяжелого меромиозина. Тяжелый меромиозин получают перевариванием миозина трипсином при комнатной температуре. К раствору миозина добавляют имидазольный буфер, приготовленный на 0,5 М КО (рН 7,6), до конечной концентрации имидазола 10 мМ и белка 30—40 мг/мл (можно меньше). Раствор трипсина в 0,5 М КО добавляют к раствору миозина, соблюдая весовое соотношение трипсин — миозин 1:100. Через 30—40 мин протеолиз останавливают добавлением раствора ингибитора трипсина из соевых бобов в двукратном избытке по сравнению с весовым количеством трипсина 9. Трипсиновый гидролизат диализуют в течение ночи

против десятикратного объема бидистиллированной воды. При этом происходит выпадение в осадок непереваренного миозина и легкого меромиозина, которые нерастворимы при низкой ионной силе. Осадок удаляют центрифугированием при 10 ООО g на центрифуге с охлаждением в течение 10 мин. Супернатант, содержащий хорошо растворимый в воде ТММ, можно использовать в качестве препарата ТММ для ряда экспериментов с АТФазной активностью, но при необходимости его подвергают последующей очистке.

Очистка препарата тяжелого меромиозина осаждением сернокислым аммонием. Наиболее простым способом очистки служит высаливание фермента сернокислым аммонием. При этом собирают фракцию, выпадающую между 40—60% насыщения Следует, однако, соблюдать два условия: во-первых, использовать сернокислый аммоний, перекристаллизованный с ЭДТА, так как даже следовые количества ионов магния, прочно связываясь с ТММ, ингибируют активность, и, во-вторых, перед добавлением к раствору фермента раствора насыщенного сернокислого аммония необходимо проконтролировать рН последнего и в случае необходимости довести его до нейтрального или слабощелочного. Выпавший в осадок тяжелый меромиозин отделяют центрифугированием, растворяют в небольшом объеме (3—6 мл) бидистиллята и диализуют при 0—4 °С в течение ночи против 1 л бидистиллированной воды, чтобы освободиться от сернокислого аммония. Внешний раствор несколько раз меняют и проводят контроль на присутствие в нем ионов S042- с помощью насыщенного раствора хлористого бария. В диализном мешочке может вновь выпасть осадок, который следует от-центрифугировать и отбросить. В надосадочной жидкости одним из общепринятых методов определяют содержание белка, которое обычно составляет 1—10 мг/мл.

Очистка препарата тяжелого меромиозина с помощью ионообменной хроматографии. Для очистки фермента можно также воспользоваться методом колоночной хроматографии. Для этого супернатант после осаждения миозина и легкого меромиозина (15—30 мл) наносят на колонку (2хН см) с ДЭАЭ-целлюлозой (ДЭАЭ-52, ватман), уравновешенную 50 мМ трис-HCl буфером, рН 7,9. После нанесения белка колонку промывают двумя объемами того же буфера. Белок элюируют линейным градиентом КО от 0 до 0,5 М (2x250 мл).

Тяжелый меромиозин элюируется с колонки одним пиком. Фракции этого пика диализуют в течение 1 ч против раствора с 5 мМ ЭДТА, затем в течение ночи против бидистиллированно

страница 201
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курсы отделом кадров москва
рабочие дни компании контактных линз коллинз в москве
вешалка напольная на плоской подставке классика
строительный паспорт кто делает

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(08.12.2016)