химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

, лишенный большей части стержня, или «хвоста», миозино-вой молекулы, а также препараты «головок». Электрофоретическая картина зависит от вида примененной протеазы, ее концентрации и времени обработки белка. «Головки», или, как их называют, субфрагмент-1, полученный путем химиотрипсинового протеолиза, при ДСН-элект-рофорезе дают полосу 96 000 Да — фрагмент тяжелой цепи, и две полосы легких цепей — примерно 18 000 и 15 000 Да. Две другие легкие цепи отсутствуют вследствие деградации. Тяжелый меромиозин обычно дает целый набор полос, среди которых присутствуют: 81 000 Да, 74 000, 51 000, 37 000, 25 000, 21 000 и некоторые другие. Большинство этих полос соответствует различным фрагментам тяжелых цепей. Следует обратить внимание на то, что, несмотря на наличие разрывов в полипептидных цепях, активность тяжелого меромиозина как АТФазы в полной мере сохраняется. АТФазную активность определяют так же, как и для миозина (с. 393).

Получение препарата миозина

Методы выделения миозина основаны на различной растворимости миозина и актомиозина в растворах солей различной ионной силы и сводятся к многократному последовательному осаждению и растворению миозина в растворах хлористого калия разной концентрации.

Реактивы7:

1. КО — х. ч. (кристаллический).

2. КС1 — 0,5 М раствор.

3. Раствор Бейли, свежеприготовленный: 0,03 М NaHC03 на 0,5 М КС1.

Получение экстракта. Мышечную ткань (15—20 г) измельчают на льду ножницами и гомогенизируют 30—40 с 1 объемом раствора Бейли. К гомогенату добавляют еще 2 объема раствора Бейли и смесь оставляют на холоде на 15—20 мин, время от времени осторожно помешивая ее стеклянной палочкой. Гомогенат центрифугируют на центрифуге с охлаждением в течение 15—20 мин при 10 000—12 000 об/мин.

7 Все растворы должны быть приготовлены на бидистиллированной воде, так как активность миозина резко падает в присутствии солей тяжелых металлов.

АЛ Г\

Осаждение актомиозина. Центрифугат фильтруют через двойной слой марли (для удаления жира) и разводят охлажденной бидистиллированной водой так, чтобы конечная концентрация КО (с учетом объема мышечной массы) была равна 0,25 М (воду добавляют медленно, при непрерывном помешивании). Если актомиозин сразу не выпадает в осадок, раствор следует оставить на холоде на 0,5—2 ч. Об

разовавшуюся желатинообразную массу энергично встряхивают и центрифугируют 15—20 мин при 12 000 об/мин. Осадок актомиозина отбра» сывают.

Осаждение миозина. Полученный центрифугат разводят бидистиллированной водой до конечной концентрации КС1 0,025—0,03 М, оставляют на 1 ч на льду и центрифугируют 20 мин при 2500 об/мин (можно оставить раствор миозина на ночь и перед центрифугированием декантировать жидкость над осадком). Осадок миозина переносят стеклянной палочкой в мерную пробирку и растворяют его добавлением сухого КО до конечной концентрации 0,5 М.

Переосаждение миозина. Раствор миозина разводят водой до концентрации КО, равной 0,03—0,04 М, осторожно перемешивают и центрифугируют 20 мин при 2500 об/мин. Осадок миозина вновь растворяют, добавляя сухой КО. Эту операцию повторяют еще раз.

Раствор миозина хранят либо при 0—4 °С в течение трех—четырех недель, либо (для длительного хранения в течение года) добавляют глицерин до 50% и помещают в морозильную камеру при —10°— —15° С.

В растворе миозина проводят определение белка одним из колориметрических методов (с. 81) и определяют активность фермента.

Определение активности полученного препарата миозина

Об активности фермента судят по количеству неорганического фосфата, который образуется при действии миозина на АТФ в присутствии Са2+

Реактивы:

1. Трис-НО буфер — 0,05 М раствор (рН 7,6), приготовленный на 0,1 М КО8.

2. СаС12 — 0,1 М раствор.

3. АТФ — 0,05 М раствор, нейтрализованный до рН 7,0.

4. СОзСООН — 5 и 7,5%-ный растворы.

5. Реактивы для определения неорганического фосфора по Фиске—Суббароу (с. 34). ,

Инкубационную смесь составляют, смешивая компоненты в следующем соотношении: на 1 мл раствора буфера 0,2 мл СаС12, 0,3 мл раствора АТФ, 0,3 мл воды. После смешивания всех компонентов проверяют рН инкубационной смеси и при необходимости вновь доводят рН до 7,5—7,6. Только после этого начинают реакцию, добавляя в пробу 0,2 мл раствора миозина, содержащего 2—3 мг белка. Смесь хорошо перемешивают и инкубируют при 26 °С в течение 3—5 мин. Реакцию останавливают добавлением 1 мл 7,5%-ного раствора СС13СООН. Раствор тотчас же фильтруют и в фильтрате определяют неорганический фосфат, образовавшийся в процессе ферментативного расщепления АТФ. Для определения предобразованного фосфата параллельно ставят контрольную пробу, в которую СОзСООН приливают к инкубационной смеси перед добавлением миозина.

8 Можно использовать также гистидиновый или имидазольный буфер {0,05 М, рН 7,2).

Для наблюдения за ходом реакции во времени готовят 10 мл инкубационной смеси такого же состава и инкубируют ее при 20 °С. Сразу же после добавления раствора миозина и в дальнейшем через каждые 1—2 мин из нее отбирают по 1 мл реакц

страница 200
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить цветы на свадьбу в москве
Компания Ренессанс: купи лестницу ру - качественно и быстро!
офисное кресло престиж
В магазине КНС Нева Рюкзак для ноутбука 17 - более 10 лет на рынке, Санкт-Петербург, Пушкинская, ул. Рузовская, д.11.

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(10.12.2016)