химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ляются две частицы фосфорной кислоты) и АДФ (отщепляется одна частица фосфата). В отсутствие АТФ и АДФ глюкозо-1-фосфат определяют по разности количества неорганического фосфата, определяемого в пробах после 10-минутного кислотного гидролиза айв пробах без гидролиза б. Если в растворе присутствуют АТФ или АДФ, их необходимо предварительно удалить в виде бариевых солей. Определение неорганического фосфата лучше проводить, используя модификацию метода по Херсу (с. 35).

Реактивы:

1. Реактивы для определения фосфорной кислоты (с. 34).

2. НС1 — 2 н. раствор.

3. NaOH — 2 н. раствор.

4. Фенолфталеин — 0,5%-ный спиртовой раствор.

5. Ва(ОН)2.

6. H2S04 — 2 н. раствор.

К безбелковому раствору добавляют равный объем 2 н. соляной кислоты, перемешивают и ставят в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем пробы охлаждают, добавляют 2 н. раствор щелочи в количестве, равном добавленной кислоте, и проводят определение неорганического фосфата. Параллельно проводят определение неорганического фосфата б (с. 35). По разности-(а—б) рассчитывают количество фосфата глюкозо-1-фосфата в исследуемой пробе.

Если в исследуемом растворе содержатся АТФ и АДФ, их предварительно удаляют в виде бариевых солей: отбирают исследуемый раствор в центрифужную пробирку, добавляют туда каплю фенолфталеина и при тщательном помешивании вносят небольшими порциями хорошо растертый порошок гидроокиси бария до появления явно выраженной розовой окраски раствора. Осадок бариевых солей АТФ, АДФ, а также неорганического фосфата удаляют центрифугированием и в центрифугате определяют глюкозо-1-фосфат. Для этого отбирают определенное количество, например 1 мл, в центрифужную пробирку, добавляют 1 мл 2 н. H2SO4 и ставят в кипящую водяную баню на 10 мин. Осадок сернокислого бария удаляют центрифугированием, центрифугат сливают в мерную пробирку, осадок промывают 2—3 раза слегка подкисленной водой, промывные воды присоединяют к основному центрифугату, нейтрализуют щелочью и определяют фосфат.

12. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТА

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПО ФОСФАТУ

Определение глюкозо-6-фосфата может быть проведено по нарастанию неорганического фосфата после щелочного гидролиза. При нагревании в 0,2 н. растворе щелочи в кипящей водяной бане за 10 мин достигается максимум гидролиза. При этом происходит гидролиз и других гексозофосфатов: глюкозо-б-фосфат, фруктозо-6-фосфат и фрук-тозодифосфат расщепляются на 65%. Глюкозо-1-фосфаг и глицерофосфат в этих условиях практически не подвергаются гидролизу.

Феактивы:

1. Реактивы для определения фосфорной кислоты (с. 34).

2. NaOH — 0,4 н. раствор.

3. НС1— 1,0 н. раствор.

4. Фенолфталеин — 0,5%-ный спиртовой раствор.

К исследуемому нейтральному раствору добавляют равный объем 0,4 н. раствора щелочи, перемешивают и ставят пробирку в кипящую водяную баню на 10 мин. Затем пробы нейтрализуют соляной кислотой до бледно-розовой окраски на фенолфталеин и проводят колориметрическое определение неорганического фосфата. Если одновременно в растворе содержится фруктозо-6-фосфат, последний определяют по фруктозе, а количество глюкозо-6-фосфата оценивают как разность между количеством фосфата после щелочного гидролиза и фосфата фруктозо-6-фосфата, рассчитанного по количеству определенной фруктозы. Если в исследуемом растворе содержится фруктозодифосфат, то последний предварительно осаждают в виде бариевой соли, которая в отличие от бариевых солей гексозомонофосфатов не растворима в щелочном растворе. Удаление из раствора фруктозодифосфата в виде бариевой соли проводят так же, как и удаление АТФ и АДФ (см. определение глюкозо-1-фосфата).

ЭНЗИМАТИЧЕСКИИ МЕТОД

Метод основан на энзиматическом окислении глюкозо-6-фосфата в глюконолактон-6-фосфат ферментом глюкозо-6-фосфатдегидрогеназой (КФ 1.1.1.49) при одновременном восстановлении НАДФ+ в НАДФН.

ft

Глюконолактон-6-фосфат в водяной среде переходит в фосфоглюконо-вую кислоту:

соон

н—с—он

но~с—н

и—с—он

2н—с—он

^Н2—О—POj

О^количестве глюкозо-б-фосфата судят по количеству образовавшегося НАДФН, измеряя оптическую плотность при 340 нм (см. с. 7).

Реактивы:

1. Глицил-глициновый буфер — 0,04 М раствор, рН 7,4.

2. MgCl2-6H20 — 12 мМ раствор, рН 7,4.

3. НАДФ+ — 7,8 мМ раствор, рН 6,5. В холодильнике может храниться несколько дней. В процессе работы должен находиться в ледяной бане.

4. Глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназа — 18 Е/мл17 (коммерческий препарат). В процессе работы хранится в ледяной бане.

5. Раствор динатриевой или калиевой соли глюкозо-6-фосфата (концентрацию рассчитывают по формуле на с. 7).

В кювету спектрофотометра помещают 2,0 мл глицил-глицинового буфера, 0,75 мл хлористого магния, 0,1 мл НАДФ и 0,1 мл исследуемого раствора. Перемешивают и измеряют оптическую плотность при 340 нм относительно контрольной кюветы, содержащей вместо исследуемого раствора 0,1 мл бидистиллированной воды. Затем в обе кюветы добавляют по 0,05 мл раствора фермента. Пробы быстро перемешивают и определяют увеличение оптической плотности до полного прекращения реакц

страница 20
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
бизнес на хранение личных вещей склад
neo vision two tone
крепеж для монитора на стол
гамак для дома купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(07.12.2016)