химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

следующие конечные концентрации реактивов: фрук-тозо-1,6-дифосфат — 2 мМ, арсенат Na — 5 мМ, НАД — 2 мМ; иммобилизованная альдолаза — 100 мкл суспензии (удобно разводить осевшую агарозу буфером в соотношении 1:1 и после этого отбирать иммобилизованную альдолазу в пробу на активность). Количество ГАФД, необходимое для полного сопряжения, подбирают экспериментально, внося в пробу нарастающие объемы растворимого препарата. Если двукратное увеличение количества фермента в пробе не приводит к росту активности альдолазы, в работе используют его предшествующий объем. Оптическую плотность измеряют с интервалом 15 с непосредственно после заполнения кюветы. Определяют величины удельной активности, Km, Утах для иммобилизованного фермента и сравнивают их с соответствующими значениями этих параметров растворимой альдолазы.

Получение комплекса иммобилизованной альдолазы с ГАФД. ГАФД из скелетных мышц кролика предварительно инкубируют 10 мин с 5 мМ дитиотреитолом и обессоливают на колонке с сефадексом G-50 в указанном ниже буфере. К иммобилизованному препарату альдолазы добавляют равный объем раствора ГАФД, имеющий концентрацию фермента 6 мг/мл. Инкубацию проводят в 50 мМ трис-HCl буфере (рН 7,5), содержащем 1 мМ ЭДТА, при постоянном осторожном перемешивании на магнитной мешалке. Время инкубации при комнатной температуре составляет 2 ч, при 4 °С — 12—14 ч. По окончании инкубации суспензию отмывают на стеклянном фильтре тем же буфером до исчезновения белка в элюате. Затем количество белка определяют с кумасси G-250 (с. 85). В качестве контроля проводят аналогичный эксперимент, инкубируя ГАФД с агарозой, полностью дезактивированной 70 мМ глицином. Отсутствие белка в данной пробе указывает на то, что неспецифической адсорбции фермента на носителе не происходит.

Убеждаются в появлении активности ГАФД (способ определения см. на с. 253) в суспензии. Измеряют активность иммобилизованной альдолазы без добавления извне растворимой ГАФД (следует отметить, что ее количество, образовавшее комплекс с иммобилизованной альдолазой, недостаточно для полного сопряжения реакции). Определяют значения удельной активности, Кт и Vmax для иммобилизованной альдолазы после комплексообразования с ГАФД в условиях полного сопряжения реакции. Рассчитывают стехиометрию образовавшегося комплекса, используя следующие значения молекулярной массы ферментов: альдолаза — 160 000 Да, ГАФД — 140 000 Да. Делают заключение о специфичности комплексообразования между использованными ферментами. Для этого делают попытку получить комплекс между иммобилизованной альдолазой из мышц кролика и лактатдегидрогеназой из мышц свиньи по описанной выше методике.

ЛИТЕРАТУРА

1. Grazi Е., Trombetta G. Aldolase-substrate intermediates and their interaction with GPDH in a reconstructed glycolitic system//Eur. J. Biochem. 1980. Vol. 107, N 2. P. 369.

2. О v a d i J., Salerno С, К e 1 e t i T. et al. Physico-chemical evidence for the interaction between aldolase and glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase//Eur. J. Biochem. 1978. Vol. 90, N 3. P. 499.

3. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. М., 1986. С. 152, 199, 212.

4. Козлова Н. Я., Мельниченко И. В., Ясников А. А. Изучение некоторых свойств иммобилизованной альдолазы/Укр. биох. журн. 1984. Т. 56, № 2. С. 194.

IV. ПОДХОДЫ К ВЫЯВЛЕНИЮ ФУНКЦИОНАЛЬНО ЗНАЧИМЫХ УЧАСТКОВ И ГРУПП МОЛЕКУЛЫ ФЕРМЕНТА

1. ПОЛУЧЕНИЕ ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФРАГМЕНТОВ МИОЗИНА, ОБЛАДАЮЩИХ АТФАЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Частичную деградацию молекулы фермента под действием различных протеаз широко используют в энзимологии как эффективный методический подход, с помощью которого могут быть решены следующие задачи:

а) выявление фрагмента белковой молекулы, содержащего регуляторный участок или активный центр, а также другие участки связывания лигандов;

б) установление аллостерической регуляции на уровне третичной

структуры фермента (десенсибилизация фермента к аллостерическому

влиянию в результате протеолиза);

в) выявление структурных доменов в молекуле фермента — участков белка, обладающих устойчивостью к протеолизу в результате повышенной жесткости или компактности упаковки белковой цепи.

Молекула миозина имеет массу 500 ООО Да и представляет собой гексамер, в состав которого входят две тяжелые цепи (м. м. ок. 200 000 Да) и четыре легкие полипептидные цепи (м. м. — 15 000— 20 000 Да). Молекула миозина сильно вытянута в длину, причем ее длинная, стержневая часть образована двумя тяжелыми полипептидными цепями, которые на этом участке имеют структуру а-спирали и к тому же закручены одна вокруг другой в суперспираль. N-концы тяжелых цепей образуют глобулярные «головки», каждая из которых находится в комплексе с двумя легкими цепями. АТФазная активность миозина сосредоточена в «головках», имеющих каждая по одному активному центру. В результате ограниченного протеолиза можно получить два типа протеолитических фрагментов, обладающих в полной мере АТФазной активностью: так называемый тяжелый меромиозин с м. м. 350 000 Да

страница 199
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
металлическая урна, со съемной крышкой-кольцом;
http://taxiru.ru/fotootchet_forum_taksi/
кровати каталог и цены официальный сайт
история лошади спектакль

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(26.09.2017)