химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

казано выше. Измеряют удельную активность иммобилизованного мономера, определяют величины удельной активности, Km и Vmax для субстратов реакции. Сравнивают полученные величины с соответствующими значениями, полученными для иммобилизованного тетрамера ЛДГ и натив-ного фермента.

Сравнение устойчивости иммобилизованной и растворимой ЛДГ по отношению к мочевине. Проводят 10-минутную инкубацию растворимой формы ЛДГ, иммобилизованных мономера и тетрамера ЛДГ в присутствии 3 М мочевины, после чего определяют активность ЛДГ. Делают заключение о стабилизирующем влиянии иммобилизации на фермент.

ЛИТЕРАТУРА

1. М о ж а ев В. В. Иммобилизация ферментов как новый подход к решению фундаментальных проблем энзимологии//Усп. биол. хим. 1983. Т. 24. С. 99.

2. Муронец В. И., Наградова Н. К. Иммобилизованные олигомерные ферменты. М„ 1984.

3. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. М., 1986. С. 22.

4. Ashmarina L. I., Muronetz V. I., Nagradova N. К. Lactate dehydrogenase can function in a monomeric form; the principles of an active subunit prepara-tion//Biochem. Intern. 1982. Vol. 3, N 4. P. 415.

4. ИММОБИЛИЗАЦИЯ АЛЬДОЛАЗЫ И ПОЛУЧЕНИЕ КОМПЛЕКСА АЛЬДОЛАЗЫ С ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗОЙ

Среди различных типов белок-белковых взаимодействий можно выделить несколько групп. Во-первых, взаимодействие химически идентичных мономеров, ведущее к образованию олигомерной молекулы фермента. Таким образом построены молекулы альдолазы и ГАФД из мышц кролика и многие другие ферменты. К другому типу взаимодействия относится формирование олигомерной молекулы из различных субъединиц, как это имеет место, например, в случае протеинкиназы из мышц. Третий тип белок-белковых взаимодействий — образование надмолекулярных комплексов, т. е. комплексов между различными белками. В частности, подобные взаимодействия имеют место между некоторыми ферментами гликолиза, между ферментами и структурными белками, между ферментами и мембранами.

Целью данной работы является получение комплекса между аль-долазой и ГАФД (оба фермента выделяются из мышц кролика) и изучение некоторых свойств альдолазы в этом комплексе.

Методическую основу работы составляет получение иммобилизованного препарата альдолазы, на котором адсорбируется добавленный извне растворимый белок. После удаления несвязанного белка при промывании увеличение концентрации белка в суспензии иммобилизованной альдолазы, а также появление в ней активности ГАФД позволяют сделать заключение о взаимодействии растворимого белка с иммобилизованным (т. е. об образовании комплекса альдолаза—ГАФД).

Реактивы:

1. BrCN-активированная агароза (производство «Олайне»,СССР),

2. Na-фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 7,4.

3. Na-фосфатный буфер — 0,1 М раствор рН 7,4, содержащий 5 мМ ЭДТА.

4. Триэтаноламиновый буфер — 0,1 М раствор, рН 7,6, содержащий 5 мМ ЭДТА.

5. Трис-HCl буфер — 50 мМ раствор, рН 7,5, содержащий 1 мМ ЭДТА.

6. Дитиотреитол — 5 мМ раствор на трис-HCl буфере.

7. Глицин.

8. Нингидрин — 0,2%-ный раствор на ацетоне.

9. Уксусная кислота.

Ш. Фосфорная кислота — 85%-ный ^раствор.

11. Этиловый спирт — 96%-ный раствор.

12. Кумасси G-250.

13. Мочевина — 8 М раствор.

14. Реактив Несслера.

15. Сефадекс G-50 (колонка 2x10 см). »

16. Фруктозо-1,6-дифосфат — 0,1 М раствор.

17. Арсенат натрия — 0,1 М раствор.

18. НАД — 50 мМ раствор.

Иммобилизация альдолазы на BrCN-активированной агарозе. В качестве носителя используется BrCN-активированная агароза, имеющая 12—14 активированных групп/мл.

Агарозу помещают на стеклянный фильтр и промывают сначала бидистиллированной водой, а затем 0,1 М Na-фосфатным буфером, рН 7,4. К суспензии агарозы, количество которой эквивалентно 1 г сухого веса носителя, добавляют 1 мл раствора альдолазы, содержащего фермент в концентрации 1 мг/мл. Предварительно альдолазу обессоливают на колонке с сефадексом G-50 в указанном буфере, содержащем 5 мМ ЭДТА. Инкубацию проводят 10 мин при комнатной температуре и постоянном осторожном перемешивании на магнитной мешалке. Добавляют глицин до конечной концентрации 70 мМ и инкубируют смесь в течение 2 ч при комнатной температуре и перемешивании. Агарозу промывают указанным буфером с ЭДТА до полного исчезновения в элюате глицина и белка. Отсутствие глицина контролируют по реакции с нингидрином (с. 131). Белок определяют по поглощению при 280 нм. Полученный препарат хранят в холодильнике.

Определение количества иммобилизованной альдолазы и числа субъединиц, вступивших в реакцию, проводят описанными выше методами (с. 386). Для растворимой альдолазы из мышц кролика используют значение AW при 280 нм, равное 9,1.

Определение активности иммобилизованной альдолазы. Активность иммобилизованной альдолазы определяют спектрофотометрически в присутствии сопрягающего фермента ГАФД по нарастанию оптической плотности при 340 нм в результате восстановления НАД. Измерения проводят в 0,1 М триэтаноламиновом буфере, рН 7,6, содержащем 5 мМ ЭДТА. Объем пробы — 3 мл.

Используют

страница 198
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
дома в клубном поселке на новой риге
КНС Нева рекомендует P1G46EA - корпоративные поставки в Санкт-Петербург.
сетка рабица отзывы
wizardfrost.ru

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(23.05.2017)