химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ют активированную бромци-аном агарозу, имеющую 12—14 активированных групп/мл. При использовании препарата-носителя с данной степенью активации получают препарат ЛДГ, иммобилизованный по четырем субъединицам. Для иммобилизации через одну субъединицу исходный препарат агарозы подвергают следующей обработке, ведущей к снижению степени ее активации.

Агарозу помещают на стеклянный фильтр и промывают вначале дистиллированной водой, а затем 0,1 М Na-фосфатным буфером, рН 7,4. Затем к 1 г агарозы (в расчете на сухой вес) добавляют 3 мл указанного буфера, содержащего глицин в концентрации 35 мМ. После 10 мин инкубации при комнатной температуре и постоянном осторожном перемешивании агарозу промывают буфером до полного исчезновения глицина в элюате. Отсутствие глицина контролируют следующим образом: к 1 мл элюата добавляют уксусную кислоту до рН 4,5, а затем 0,2 мл 0,2%-ного раствора нингидрина. Сразу после этого ставят на 5 мин в кипящую баню. При наличии в пробе глицина раствор приобретает фиолетовую окраску.

Иммобилизация ЛДГ. К уплотненному гелю агарозы, сформировавшемуся при оседании агарозы в буфере, в количестве, эквивалентном 3 г сухого веса носителя, добавляют 3 мл раствора ЛДГ в концентрации 1 мг/мл. ЛДГ предварительно обессоливают на колонке с сефадексом G-50, уравновешенной 0,1 М Na-фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 5 мМ ЭДТА. Инкубацию проводят в течение 10 мин при комнатной температуре и постоянном осторожном перемешивании. Реакцию останавливают добавлением глицина до конечной концентрации 70 мМ и спустя 2 ч, в течение которых суспензия находится при комнатной температуре и постоянном помешивании, агарозу отмывают буфером от глицина и адсорбированного белка, контролируя их отсутствие по реакции с нингидрином (белок можно контролировать по поглощению раствора при 280 нм). Полученный препарат хранят в холодильнике.

Определение концентрации иммобилизованной ЛДГ. Концентрацию иммобилизованной ЛДГ определяют по модифицированному методу Бредфорд (с. 85). Приготовленный раствор Кумасси G-250 хранят при комнатной температуре в защищенном от света месте. Через 2—

3 нед следует проверить качество реактива. При построении калибровочной кривой используют полностью инактивированную глицином ага-розу. Суспензию агарозы удобно вносить после добавления буфера к осевшей агарозе в соотношении 1:1. Все пробы непосредственно перед измерением тщательно перемешивают стеклянной палочкой (в идеальном случае содержимое кюветы перемешивается во время измерения). При работе с ЛДГ из мышц свиньи используют А /см при 280 нм=14,0; для ЛДГ из мышц кролика — А /см при 280 нм= 14,5.

Определение числа субъединиц, вступивших в реакцию. Число субъединиц, образовавших ковалентную связь с носителем, определяют измерением концентрации белка в пробах, обработанных 8 М мочевиной, сравнивая ее с исходной концентрацией иммобилизованного фермента.

Вначале суспензии агарозы с иммобилизованным ферментом промывают 0,1 М Na-фосфатным буфером, рН 7,4, затем небольшим объемом 8 М мочевины, после чего добавляют двойной объем раствора мочевины и оставляют на 1 ч при комнатной температуре (или на ночь при 4°С), используя для перемешивания магнитную мешалку. Удаляют раствор мочевины и вновь промывают сначала небольшим объемом 8 М мочевины, а затем указанным выше буфером. Отсутствие мочевины в пробах контролируют с помощью реактива Несслера. Белок в суспензии определяют описанным выше способом. Снижение концентрации белка в суспензии вызвано диссоциацией субъединиц фермента, не образовавших ковалентных связей с группами носителя.

Следует отметить, что при связывании белка с носителем более чем за одну субъединицу в силу вероятностных факторов возникает набор различных форм белка, имеющих разное число «пришитых» субъединиц, и полученный результат является усредненным.

Определение активности иммобилизованной ЛДГ. Активность иммобилизованного фермента определяют так, как описано на с. 299.

Ввиду использования высоких концентраций НАДН, имеющих оптическую плотность выше 1,5 ед. при 340 нм, измерения проводят не в максимуме поглощения НАДН, а при другой длине волны. Для этого обращаются к спектру поглощения НАДН, приведенному в приложении на с. 501. Пользуясь тем, что коэффициент молярной экстинкции НАДН при 340 нм равен 6,22-103 М-1 см-1, рассчитывают его значение при других длинах волн. Для измерения активности ЛДГ выбирают длину волны, при которой поглощение раствора не превышает 0,6.

Получение иммобилизованного мономера ЛДГ. К одному объему геля агарозы, несущей иммобилизованный тетрамер ЛДГ, добавляют два объема 1,5 М мочевины. Инкубацию проводят в течение 3 ч при комнатной температуре и постоянном осторожном перемешивании, после чего агарозу промывают 10 объемами 1,5 М мочевины, а затем 0,1 М Na-фосфатным буфером (рН 7,4) до полного исчезновения белка в пробе (контролируют по поглощению раствора при 280 нм). Отсутствие в пробе мочевины контролируют с помощью реактива Несслера. В полученной суспензии определяют содержание белка, как у

страница 197
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
стенды для керамической плитки
Садовая мебель
масленка фислер
детский шатер купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(05.12.2016)