химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

димеры проводят при одновременном воздействии низкой температуры, моновалентных анионов и АТФ. Для этого суспензию агарозы с иммобилизованным ферментом вначале промывают раствором 0,15 М NaCl с 5 мМ ЭДТА (рН 7,5), а затем добавляют к ней равный объем 0,1 М раствора АТФ в 0,15 М NaCl с 5 мМ ЭДТА при том же рН и помещают на лед. За ходом диссоциации следят по падению активности фермента, так как переходящий в раствор димер в этих условиях быстро инактивируется. В то же время димер, связанный с носителем, остается активным, что обусловлено стабилизирующим действием матрицы. В пробы для определения активности ГАФД (отбирают каждые 15 мин) вносят суспензию носителя с белком без отмывания АТФ, так как присутствие последнего в используемых концентрациях мало влияет на активность фермента.

Достигнув двукратного снижения активности, АТФ отмывают вначале 0,15 М NaCl с 5 ММ ЭДТА (рН 7,5), а затем 0,1 М Na-фосфатным буфером (рН 8,3), содержащим 5 мМ ЭДТА. В полученном препарате определяют концентрацию белка и рассчитывают удельную активность, сравнивая ее с удельной активностью препарата до проведения диссоциации. При иммобилизации ГАФД за одну субъединицу препарат содержит гомогенные димеры, при иммобилизации за две — смесь димеров и тетрамеров.

Реассоциация иммобилизованных димеров с растворимыми проводится следующим образом. К иммобилизованным димерам добавляют 1—2 объема раствора фермента в 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН7,2), содержащем 5 мМ ЭДТА так, чтобы конечная концентрация фермента в суспензии была равна 0,2—0,3 мг/мл. Инкубацию проводят в течение ночи при 4 °С, а затем отмывают суспензию указанным буфером. Измеряют активность и содержание белка в препарате и убеждаются в восстановлении тетрамерной структуры фермента и общей активности препарата.

*

ЛИТЕРАТУРА

1. Ashmarina L. I., Muronetz V. I., Nagradova N. К. A monomer of gly-ceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is catalytically active //Biochem. Intern. 1980. Vol. 1, N 1. P. 47.

2. Ashmarina L. I., Muronetz V. I., Nagradova N. K. Immobilized D-gly-ceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase can exist as a trimer//FEBS Lett. 1981. Vol. 128, N 1. P. 22.

3. Mo ж а ев В. В. Иммобилизация ферментов как новый подход к решению фундаментальных проблем энзимологии//Усп. биол. хим. 1983. Т. 24. С 99.

4. Муронец В. И., Наградова Н. К. Иммобилизованные олигомерные ферменты. М., 1984.

5. Фридрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы. М., 1986. С. 22.

3. ИММОБИЛИЗАЦИЯ ЛАКТАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Изозим М4 лактатдегидрогеназы (ЛДГ), который используется в работе, состоит из четырех химически идентичных субъединиц, каждая из которых формирует один активный центр. Получение и изучение димеров и мономеров ЛДГ в растворе представляет собой весьма сложную задачу.

Иммобилизация ЛДГ на активированной бромцианом агарозе позволяет достаточно легко получать различные формы ЛДГ, в частности мономер. В зависимости от условий эксперимента и степени активации носителя в образовании ковалентных связей между белком и ага-розой может участвовать различное число субъединиц фермента. Необходимым условием получения мономерной формы является наличие препарата ЛДГ, иммобилизованного через одну субъединицу.

Определение количества субъединиц, вступивших в реакцию, проводится путем сравнения концентрации иммобилизованного белка до и после обработки 8 М мочевиной. Снижение концентрации белка в суспензии агарозы после инкубации в мочевине в 4 раза позволяет использовать препарат ЛДГ для получения мономера. Обработка иммобилизованного белка 1,5 М мочевиной приводит к разрушению не-ковалентных взаимодействий между субъединицами ЛДГ, но не влияет на ковалентную связь субъединицы с матрицей (агарозой). Удаление мочевины из системы при промывании буфером ведет одновременно и к удалению диссоциировавших субъединиц. Остающийся связанным белок является мономером ЛДГ, который используется для дальнейших исследований.

6 Аналогичным образом может быть проведена иммобилизация и получение мономера лактатдегидрогеназы из мышц кролика.

Целью работы является получение активного мономера лактатдегидрогеназы (ЛДГ) из мышц свиньи6, сравнение каталитических характеристик растворимого фермента и различных форм иммобилизованного белка (тетрамера и мономера), а также изучение стабильности иммобилизованного и растворимого ферментов.

Реактивы:

1. BrCN-активированная агороза (производство «Олайне», СССР).

2. Na-фосфатный буфер — ОД М раствор, рН 7,4.

3. Na-фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 7.0 и 7,4, содержащий 5 мМ ЭДТА.

4. Глицин — 35 мМ раствор.

5. Нингидрин — 0,2%-ный раствор в ацетоне.

6. Уксусная кислота.

7. Фосфорная кислота — 85%-ный раствор.

8. Этиловый спирт — 96%-ный раствор.

9. Кумасси G-250.

10. Мочевина — 8 М раствор.

11. Реактив Несслера.

12. НАДН — 60 мМ раствор.

13. Пируват натрия — 60 мМ раствор.

14. Сефадекс G-50 (колонка 2X10 см).

Подготовка носителя к работе. В качестве матрицы, на которой иммобилизуют фермент, в работе использу

страница 196
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
профнастил в сосновском районе нижегородской области
Стол LM LMT-102
кронштейны для монитора на стол
Набор высоких стаканов 450 мл киви 2 шт.

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)