химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ду неблагоприятных факторов, например к действию мочевины. Таким образом, возникает возможность решить вопрос о необходимости тетрамерной структуры для проявления ферментом каталитической активности, а также сделать определенные заключения о роли иммобилизации как фактора, стабилизирующего фермент.

При образовании ковалентной связи между носителем и двумя субъединицами ГАФД в силу вероятностных факторов образуется набор различных форм иммобилизованного фермента. На рис. 47 пунктиром указана ось, по которой происходит диссоциация тетрамера, один из функциональных димеров заштрихован, образование связи с носителем равновероятно для всех субъединиц.

В подобной системе существуют два разных типа иммобилизованных тетрамеров: в первом из них связь с носителем образуют субъединицы одного димера, во втором — по одной субъединице из разных димеров. В диссоциирующих условиях тетрамер I типа переходит в два димера: иммобилизованный и растворимый (который в дальнейшем удаляется при промывании), тетрамер II типа остается неизменным. Таким образом, при иммобилизации ГАФД через две субъединицы возможно получить систему, содержащую одновременно димеры и тетра-меры. Корреляция удельной активности фермента с рассчитанным количеством образовавшихся димеров и сохранившихся тетрамеров позволяет судить об активности димерной формы.

Целью работы является сравнение кинетических характеристик ГАФД, растворимой и связанной с нерастворимым носителем, а также получение иммобилизованного димера фермента и изучение его свойств. Методической основой работы является иммобилизация ГАФД на активированной бромцианом агарозе.

Реактивы:

1. BrCN — активированная агароза (производство «Олайне», СССР).

2. Na-фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 8,3.

3. Na-фосфатный буфер — 0,1 М раствор, рН 8,3 и 7,2, содержащий 5 мМ ЭДТА.

4. Глицин — 35 мМ раствор.

5. Нингидрин — 0,2%-ный раствор в ацетоне.

6. Уксусная кислота.

7. Фосфорная кислота — 85%-ный раствор.

8. Этиловый спирт — 96%-ный раствор.

9. Кумасси G-250.

10. Мочевина — 8 М раствор.

11. Реактив Несслера.

12. Глициновый буфер — 0,1 М раствор, рН 8,9.

13. ЭДТА — 0,1 М раствор.

14. Арсенат натрия — 0,1 М раствор.

15. НАД — 60 мМ раствор.

16. Фосфоглицериновый альдегид — 45 мМ раствор.

17. Сефадекс Сг-50 (колонка 2x10 см).

18. NaCl — 0,15 М раствор, содержащий 5 мМ ЭДТА, рН 7,5.

19. АТФ — 0,1 М раствор, приготовленный на 0,15 М NaCl и 5 мМ ЭДТА, рН 7,5.

Иммобилизация ГАФД. В качестве матрицы, на которой иммобилизуют фермент, в работе используют активированную бромцианом ага-розу, имеющую 12—14 активированных групп/мл. Для получения препаратов ГАФД, иммобилизованных через одну или две субъединицы, данная степень активации носителя должна быть понижена. Соответствующая обработка агарозы описана на с. 387.

После подготовки носителя к работе суспензию агарозы уравновешивают 0,1 М Na-фосфатным буфером, рН 8,3 (этот буфер может быть сразу использован в процессе обработки агарозы глицином). К уплотненному гелю агарозы (сформировавшемуся после оседания носителя), количество которого эквивалентно 1 г сухого веса агарозы, добавляют 3 мл раствора ГАФД в концентрации 3 мг/мл, предварительно обессоленного в 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 8,3, содержащем 5 мМ ЭДТА. Для обессоливания используют колонку с сефадексом G-50. Инкубацию ведут 10 мин при комнатной температуре и постоянном осторожном перемешивании. Реакцию останавливают добавлением глицина до конечной концентрации 70 мМ и спустя 1 ч, в течение которого проба перемешивается, агарозу отмывают от адсорбированного белка и глицина. Их отсутствие в элюате определяют соответственно по исчезновению поглощения при 280 нм .и с помощью нингидрина (с. 131). Определение концентрации иммобилизованного белка и числа субъединиц, вступивших в реакцию, проводят описанными выше методами (с. 386). Для растворимой ГАФД из мышц кролика используют значение лПм при 280 нм=12,7. Все эксперименты проводят в 0,1 М Na-фосфатном буфере, рН 8,3.

Методика позволяет получать препараты фермента, иммобилизованные не более чем за две субъединицы. Следует отметить, что при иммобилизации более чем за одну субъединицу в препаратах присутствуют также формы, иммобилизованные за 3 и 4 субъединицы, в количествах, определяющихся вероятностными факторами.

Определение активности иммобилизованной ГАФД. Активность фермента определяется спектрофотометрически по увеличению оптической плотности при 340 нм в результате образования НАДН в ходе реакции. Измерения ведут при комнатной температуре в глициновом буфере 0,1 М, рН 8,9. Реакционная среда содержит 5 мМ ЭДТА, 5 мМ арсенат Na, 3 мМ НАД, 1,5 мМ фосфоглицериновый альдегид и 0,1—0,2 мл суспензии иммобилизованного фермента. Реакцию начинают добавлением субстрата. Проводят сравнение удельной активности, значений Km и Vmax для иммобилизованных форм фермента и растворимого фермента.

Получение иммобилизованных димеров ГАФД и их реассоциация с растворимыми димерами. Диссоциацию тетрамеров фермента на

страница 195
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
купить кафельную плитку для ванной
Стол журнальный DIK Альт 41-21
обучение массажу
little big нижний новгород

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(06.12.2016)