химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

9° С на 10 мин. б'-нуклеотидаза, содержащаяся в яде змеи, катализирует реакцию, определенную уравнением (7). За указанное время гидролиз АМФ до аденозина проходит практически полностью.

Для отделения негидролизоваиного субстрата цАМФ от гидроли-зованного в инкубационную смесь добавляют 1 мл тщательно перемешанной водной суспензии Дауэкса 1x2 в объемном соотношении 1:1. После встряхивания пробирки пробу центрифугируют и супернатант в объеме 300 мкл помещают во флакон. После добавления диоксаио-вого сцинтиллятора измерение радиоактивности проводят на жидкостном сцинтилляционном счетчике. ^

Схема расчета активности фосфодиэстеразы

Для определения активности фермента с помощью радиоактивной метки первоначально находили параметры рабочей среды: фон (радиоактивность в отсутствие фермента) и полный гидролиз (радиоактивность при высоких концентрациях фермента и избыточном времени реакции, позволяющем провести гидролиз цАМФ практически полностью).

Удельную активность фермента рассчитывали, используя следующие формулы:

1) срт—Ф=Л,

где срт — величина радиоактивности, соответствующая текущему измерению; Ф — величина остаточной радиоактивности пробы в отсутствие фермента;

2) ПГ—Ф=ПГ,

где ПГ — величина счета, соответствующая полному прохождению реакции гидролиза цАМФ в пробе.

Принимая величину ПГ' за 100% гидролиза цАМФ, находят количество гидролизованного в ходе ферментативной реакции субстрата:

у А • С, мкмоль

где С — начальная концентрация цАМФ в инкубационной среде, У —

концентрация гидролизованного в ходе реакции субстрата.

Тогда

, У, мкмоль

удельная активность фермента = —?

t, мин -В, мг

где У — количество гидролизованного субстрата, t — время реакции гидролиза, В — количество белка в пробе.

Для оценки активности фермента удобно пользоваться относительной единицей активности фермента (О.Е.А.):

О Е А ~ у> мкмоль g t, мин-fi, мкл

где В — объем препарата фермента в пробе.

1. Измеряют активность фосфодиэстеразы в присутствии Са2+ и кальмодулина на профиле элюции фермента при повторной хроматографии на ДЭАЭ-ТСК. Фракцию с максимальной активностью отбирают для дальнейшего использования в экспериментах. Хранят при температуре -f-4°C.

2. Исследуют зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации цАМФ.

Диапазон концентраций цАМФ:

а) 5-Ю"4—2-10~3 М (в присутствии 1 мкМ КМ);

б) 5-Ю-5—Ю-4 М (в присутствии 20 мкМ ЭГТА).

На основании данных экспериментов определяют изменения в эффективных величинах максимальной скорости гидролиза и константы сродства фермента к субстрату при активации фосфодиэстеразы комплексом КМ—Са2+.

3. Исследуют влияние трифторпиразина и его синтетического аналога W—7 на активность фосфодиэстеразы. В присутствии 50 и 100 нМ

кальмодулина определяют зависимость скорости ферментативной реакции от антагонистов кальмодулина в диапазоне концентраций Ю-6—

Ю-4 М. Проводят оценку механизма действия антагонистов кальмодулина на фосфодиэстеразу

ЛИТЕРАТУРА

1. К lee С. В., Van am an Т. С. Calmodulin. Advances in protein Chemistry. 1982. Vol. 35. P. 254, 268, 281.

2. Бобрускин И. Д, Шайхин С. М., Муратова М. В., Баранова Л. А., Северин Е. С. Аллостерическая регуляция активности Саа+-калмодулинзависи-мой фосфодиэстеразы из мозга крупного рогатого скота/Биохимия. 1987. Т. 52, № 8. С. 1344.

2. ИММОБИЛИЗАЦИЯ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (ГАФД) представляет собой тетрамер, состоящий из химически идентичных субъединиц, каждая из которых формирует один активный центр. Тетрамерная молекула фермента построена по типу димера димеров, т. е. в определенных условиях молекула фермента диссоциирует на два равноценных димера. Это обусловлено тем, что прочность контактов между субъединицами по одной из трех осей симметрии существенно ниже, чем по двум другим, и диссоциация происходит в первую очередь в результате нарушения взаимодействия субъединиц именно по этой оси. При инкубации фермента в растворе в присутствии моновалентных анионов и адениловых нуклеотидов при низкой температуре тетрамерная молекула ГАФД диссоциирует на димеры, которые в растворе достаточно быстро теряют активность. Дальнейшей диссоциации димеров на мономеры в этих условиях не происходит. Своевременное удаление факторов диссоциации ведет к восстановлению тетрамерной структуры ГАФД и ее активности.

Используя фермент, иммобилизованный на нерастворимом носителе, можно создать условия, при которых часть образовавшихся димеров будет находиться в растворе и таким образом может быть удалена из системы, в то время как остальные димеры останутся связанными с носителем. Если в образовании ковалентной связи с носителем участвует одна субъединица молекулы фермента, можно получить гомогенную фракцию иммобилизованных димеров. Реассоциация димеров, связанных с носителем, не происходит из-за ограничения в подвижности матрицы.

Полученные иммобилизованные димеры ГАФД могут быть использованы для определения активности фермента и его устойчивости к ря

страница 194
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
курс учобы газы котлы
промывка кондицонера в автомобиле
Выгодно кликнуть на ссылку - скидка в KNS по промокоду "Галактика" - Kyocera FS-4100DN с доставкой по Москве и по 100 городам России.
оса 501-050-н-00400/2-у2

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(03.12.2016)