химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

уре — 70 °С, измельчают, не дожидаясь нагревания, и гомогенизируют в 250 мл охлажденного буфера А (гомогенизатор типа «Политрон», время гомогенизации — 3—5 мин). Гомогенат центрифугируют в течение 1 ч при 22 000 g («Весктап» /—21, ротор С—14, г=2°С).

Хроматография на ДЭАЭ-ТСК. После центрифугирования супернатант наносят на колонку с анионообменной смолой ДЭАЭ-ТСК (объем колонки ~50 мл), предварительно уравновешенную буфером Б. После нанесения супернатанта смолу промывают пятикратным объемом (250 мл) буфера А, содержащего 50 мМ NaCl. Элюцию фосфодиэстеразы осуществляют тем же буфером, содержащим NaCl в конечной концентрации 0,15 М. При этом первые 50 мл (объем колонки) элюата отбрасываются. Конечный объем собранного элюата —161) мл. Все операции на колонке с ДЭАЭ-ТСК проводят со скоростью 5 мл/мин.

Хроматография на фенил-сефарозе. Разбавленный в два раза буфером Б элюат с ДЭАЭ-ТСК после добавления в него СаС12 до конечной концентрации 1 мМ наносят на колонку с фенил-сефарозой, предварительно уравновешенную буфером Б, содержащим 1 мМ СаС12. Объем колонки 20 мл. Смолу промывают буферным раствором Б, содержащим ОД М NaCl и 1 мМ СаСЬ до исчезновения показаний оптической плотности при длине волны 280 нм (на увикорде) в диапазоне 0,05 опт. ед. Скорость промывки — 1 мл/мин. Элюцию фосфодиэстеразы с фенил-сефарозы проводят буфером В. Скорость элюции— 1 мл/мин. Элюцию белка контролируют по изменению оптической плотности при длине волны 280 нм. Элюат собирают до исчезновения оптической плотности. В отсутствие увикорда контроль выше перечисленных операций можно осуществить по объему буфера. При промывке объем буфера близок к пяти, а при элюции — к трем объемам колонки. Фракционирование элюата необходимо начать, пропустив объем элюирующего буфера, равный объему колонки.

Повторная хроматография на ДЭАЭ-ТСК. Элюат с фенил-сефарозы наносят на колонку* ДЭАЭ-ТСК объемом 20 мл, предварительно уравновешенную буфером В, и промывают 60 мл этого буфера. Элюцию фермента осуществляют линейным градиентом NaCl (0—0,3 М) в буфере В. Объем буфера в камерах градиентатора — 2x100 мл. Скорость элюции — 2 мл/мин. Фракционирование необходимо проводить в пробирки по 4 мл.

Определение активности фосфодиэстеразы

Реактивы:

1. цАМФ (концентрацию выбирают, исходя из цели эксперимента).

2. Трис-HCl — 50 мМ (рН 7,0).

3. Ацетат магния — 1 М раствор.

4. Змеиный яд — 2 мг/мл.

5. ЭГТА — 2 • 10—2 М, рН 7,0.

6. Кальмодулин — 10~4 М раствор.

7. СаС12 — 10~2 М раствор.

8. 50% -ный этанол.

9. Рабочая смесь:

а) трис-HCl - 50 мМ, рН 7,0;

б) ацетат магния — 10 мМ раствор;

в) цАМФ раствор;

г) (3Н)-цАМФ — 0,3—0,4 мкКи, раствор.

Активность фосфодиэстеразы определяют по двустадийной методике Томпсона с применением меченного по тритию цАМФ, в основе которой лежит двухступенчатая реакция:

3', 5'-цАМФ-^-»-АМФ; (6)

АМФ 5'-нУ*леотидаза ^ (7)

29°С

Первая стадия. На первой стадии реакции фосфодиэстера-за гидролизует 3', 5'-цАМФ до АМФ (6). Реакцию проводят в инкубационной среде, состоящей из 50 мМ трис-HCl (рН 7,0), 10 мМ ацетата магния, цАМФ как субстрата реакции (концентрацию цАМФ выбирают в зависимости от целей эксперимента) и 0,3—0,4 мкКи (3Н)-цАМФ для определения скорости реакции по изменению концентрации радиоактивного изотопа в пробе. Дополнительно в соответствий с поставленной задачей инкубационная среда может содержать ЭГТА для определения активности фосфодиэстеразы; свободной от кальмодулина или Са2+ и кальмодулина для активации фермента, различные комбинации концентрации Са2+, кальмодулина и его антагонистов для определения действия последних на комплексе Са2+—КМ—ФДЭ.

Для удобства проведения эксперимента инкубационную среду разделяют на два равных объема по 100 мкл каждый. Первый объем состоит из смеси буфера, различных добавок и фермента. Второй — так называемая «рабочая смесь», состав которой приведен в списке реактивов. Обычно реакцию начинают добавлением раствора 2 в раствор 1. Все компоненты инкубационной среды-берут с учетом последующего разбавления, возникающего при смешивании. Реакцию проводят в термостате при 29 °С. Время реакции определяют по величине процента гидролиза цАМФ в конкретной серии экспериментов. Для достоверности экспериментальных данных необходимо удерживать минимальный гидролиз цАМФ в области 10% и максимальный — в области 70% (расчет процента гидролиза цАМФ в пробе на с. 382). Останавливают реакцию, катализируемую фосфодиэстеразой, кипячением инкубационной смеси в течение 1,5 мин

При работе с антагонистами кальмодулина важна последовательность добавления компонентов первого раствора: 1) буфер, 2) каль-модулин, 3) антагонист, 4) фермент. После тщательного перемешивания раствор преинкубируют 10 мин, затем добавляют второй раствор, начиная тем самым реакцию (7). Во всех экспериментах объем первого раствора доводят буфером до 100 мкл.

Вторая стадия. После охлаждения до 25—30°С в инкубационную среду добавляют 0,2 мг/мл змеиного яда, тщательно перемешивают и помещают в термостат при 2

страница 193
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
посуда для посудомоечной машины купить
обучение дизайнеров одежды
купить новогодний подарок ребенку в интернет магазине
в липецке купить дартс

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)