химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

3 мг лецитина) в 1 мл раствора фермента, содержащего различные количества единиц используемого фермента, а также 15 мМ MgCl2 или 5 мМ глюкозу в качестве адсорбирующих реагентов. Контрольная проба адсорбирующих реагентов не содержит. После 30-минутной инкубации при 0° С мембраны, содержащие адсорбированную гексокиназу, отделяют центрифугированием при 100 ООО g в течение 1 ч и суспендируют в среде инкубации. Препарат иммобилизованной гексокиназы используют для изучения свойств в день получения.

Степень адсорбции гексокиназы определяют, сравнивая активности фермента в среде инкубации до и после контакта с мембранами:

степень адсорбции = А*~~Аа -100%,

Ai

где Ai — исходная активность гексокиназы до иммобилизации, Л? —• остаточная активность гексокиназы в супернатанте после отделения мембран с иммобилизованным ферментом.

Об активации гексокиназы при адсорбции судят, сравнивая активность фермента, обнаруженного в мембранном препарате, с убылью исходной активности после иммобилизации:

степень активации = —— 100 %,

Ах — А3

где А3 — активность фермента, связанного с липосомами.

Определение активности гексокиназы. Активность фермента определяют энзиматическим методом по количеству образовавшегося в ходе реакции Г-6-Ф. Метод основан на использовании сопряженной де-гидрогеназной реакции согласно схеме (с. 41). За ходом реакции следят на спектрофотометре по увеличению оптической плотности при 340 нм в результате восстановления НАДФ+. Показания прибора регистрируют каждые 30 с в течение 3 мин.

Состав реакционной среды объемом 3 мл: 50 мМ трис-HCl буфер» рН 7,8, глюкоза — 3 мМ, АТФ — 8 мМ, MgCl2 — 12 мМ, НАДФ — 0,25 мМ, дегидрогеназа Г-6-Ф — 1 инт. ед. в пробе. Контрольная проба не содержит глюкозу. Реакцию начинают добавлением ферментного препарата.

Расчет активности фермента проводят на основании величин начальной скорости реакции при условии наличия прямой пропорциональной зависимости скорости от количества ферментного препарата в пробе. Скорость гексокиназы выражают в микромолях восстановленного НАДФ+ в мин.

Изучение свойств фермента

1. Получают препарат II изозима гексокиназы из растворимой клеточной фракции скелетных мышц крысы. После определения белка микробиуретовым методом оценивают удельную активность фермента, а также степень очистки. При этом учитывают, что на долю II изозима гексокиназы приходится 60% от общего содержания фермента в растворимой клеточной фракции скелетных мышц.

2. Поскольку кроме II изозима гексокиназа скелетных мышц содержит в больших количествах I изозим фермента (до 40%), проводят идентификацию изозимного состава полученного препарата гексокиназы. В качестве критерия при этом используют значение Кт по глюкозе, соответственно равное для I и II изозимов 5-Ю-5 М и (1,8—2,4) X X Ю-4 М. С этой целью исследуют зависимость скорости реакции от концентрации глюкозы в диапазоне 3-Ю-5 — 5-Ю-4 М, используя насыщающую (8-10~3 М) и полунасыщающую (7-Ю-4 М) концентрацию АТФ. В работе используют препараты гексокиназы с высоким содержанием II изозима фермента, для 'которых характерно значение Кт по глюкозе не ниже 1,8-Ю-4 М.

3. Изучают влияние 15 мМ MgCl2 и 5 мМ глюкозы на способности гексокиназы связываться с липосомами. С этой целью сопоставляют активность гексокиназы, связанной с липосомами в присутствии и в отсутствие указанных реагентов. Исходная активность фермента в этих экспериментах составляет 0,25 инт. ед. Оценивают степень активации гексокиназы при иммобилизации на мембранах.

4. Проводят сравнительное исследование зависимости скорости реакции от концентрации глюкозы для связанной с липосомами и свободной форм фермента в диапазоне концентраций субстрата 3-10-5— 5 -10""4 М. Различными графическими методами оценивают значения Кт по глюкозе. Препарат связанной гексокиназы получают в присутствии в среде для иммобилизации 15 мМ MgCl2 и 5 инт. ед. гексокиназы.

5. Исследуют рН-зависимость активности связанной и свободной фюрм гексокиназы в диапазоне изменений рН 7,0—8,5. Поскольку прочность связи фермента с мембранами уменьшается при закислении среды, иммобилизацию фермента в данной серии экспериментов проводят при рН 7,0; содержание фермента в пробе составляет 5 инт. ед.

ЛИТЕРАТУРА

1. Курганов Б. И., Л обод а Н. И. Регуляция активности ферментов в адсорбционных ферментных системах//Биоорг. хим. 1977. Т. 3, № 10. С. 1407

U. Фрндрих П. Ферменты: четвертичная структура и надмолекулярные комплексы/ /Под ред. С. Е. Северина, Н. Б. Гусева. М, 1986.

"3. Марголис Л. Б., Бергельсон Л. Д. Липосомы и их взаимодействие с клетками М, 1986.

4. Мунтян Е. М., Гончарова Н. Ю. О специфичности взаимодействия изозима И гексокиназы с митохондриальными мембранами//Биохимия. 1986. Т. 51, № 3. С 404

5. Гончарова Н. Ю., Мунтян Е. М. Взаимодействие изозима II гексокиназы с лецитиновыми липосомами//Биохимия. 1986. Т. 51, № 7. С 1077.

6. Szoka F., Popahadjopoulos D. Comperative properties and methods of preparation of lipid vesicles (liposomes)//Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 198ц. Vol.

страница 191
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
вешалка sheffilton 12536
обрезание у мужчин цена в красноярске
смесительный узел smex 80-6.3 нагреватель цена
Кликай, преобретай выгодней со скидкой по промокоду "Галактика" в KNS - HP LaserJet Pro M201dw купить в Москве и более чем в 100 городах России.

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)