химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

нента мембран и регулируется внутриклеточными метаболитами. Так, Mg2+ и глюкоза являются адсорбирующими фермент реагентами, АТФ и глюкозо-6-фос-фат (Г-6-Ф) солюбилизируют фермент, контролируя тем самым соотношение разных по каталитической эффективности форм фермента

В задаче исследуется взаимодействие изозима II гексокиназы скелетных мышц крысы с искусственной фосфолипидной мембраной (леци-тиновые липосомы), имитирующее поведение фермента при иммобилизации на биологической мембране.

Реактивы:

1. К-фосфатный буфер — 10 мМ раствор, рН 7,0.

2. Трис-HCl буфер — 50 мМ раствор, рН 7,8.

3. КС1 — 200 мМ раствор, приготовленный на 10 мМ К-фосфат-ном буфере, рН 7,0.

4. Суспензия ДЭАЭ-целлюлозы, уравновешенная 10 мМ К-фос-фатным буфером, рН 7,0.

5. Сульфат аммония (перекристаллизован с ЭДТА).

6. MgCl2 — 0,5 М раствор.

7. Яичный лецитин.

8. Холат натрия.

9. Глюкоза — 90 мМ раствор.

10. АТФ — 240 мМ раствор.

11. НАДФ — 7,5 мМ раствор.

12. Дегидрогеназа Г-6-Ф — коммерческий препарат (разводят перед использованием 50 мМ трис-HCl буфером, рН 7,8, до конечной концентрации 60 инт. ед./мл).

13. Реактивы для определения белка микробиуретовым методом в присутствии 1 %-ного дезоксихолата натрия.

14. Дитиотреитол.

Получение растворимой клеточной фракции скелетных мышц крысы. Все процедуры по получению препаратов гексокиназы проводят при 0°С.

Среда выделения: 10 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,0. Навеску (~5 г) измельченной мышечной ткани (получение см. на с. 49) гомогенизируют в стеклянном гомогенизаторе Поттера с теф-лоновым пестиком с нарезкой. Тканевый гомогенат после 20-минутной инкубации при помешивании центрифугируют при 15 000 g в течение 20 мин. Супернатант после центрифугирования представляет собой 14%-ную растворимую клеточную фракцию. Препарат фильтруют через 4 слоя марли и хранят при 0°С в течение суток.

Получение препарата II изозима гексокиназы. К растворимой клеточной фракции добавляют при помешивании суспензию ДЭАЭ-целлю-лозы из расчета: 1 мл фракции — 5—10 мг сухой ДЭАЭ-целлюлозы. После 10-минутной инкубации суспензию фильтруют с помощью водоструйного насоса на воронке Бюхнера. Осадок ДЭАЭ-целлюлозы с адсорбированной гексокиназой промывают К-фосфатным буфером, содержащим 40 мМ КС1 (объем равен половине исходного объема растворимой клеточной фракции). Затем гексокиназу элюируют 200 мМ КС1, приготовленным на К-фосфатном буфере. В целях концентрирования препарата гексокиназы объем элюирующего раствора уменьшен в 3 раза по отношению к исходному объему растворимой клеточной фракции. После 10-минутной инкубации элюат отделяют на воронке Бюхнера.

К полученному элюату добавляют дитиотреитол до конечной концентрации 1 мМ и сухой сульфат аммония до 50%-ного конечного насыщения. После 20-минутного перемешивания осадок белка отделяют центрифугированием при 12 000 g в течение 10 мин и растворяют в небольшом объеме 50 мМ трис-HCl буфера, рН 7,8, содержащего 1 мМ дитиотреитол. Препарат фермента можно хранить в виде сульфатам-монийного осадка при 0 °С в течение нескольких дней.

Получение препарата лецитиновых липосом. а. Метод быстрого удаления детергента. Препарат яичного лецитина освобождают на роторном испарителе от органического растворителя и растворяют в холате натрия, приготовленном на 50 мМ трис-HCl буфере, рН 7,8, в молярном соотношении фосфолипид—детергент, равном 2:1 (м. м. лецитина — 800 Да, м. м. холата — 450 Да). Для удаления детергента раствор лецитина пропускают дважды через колонку с анионитом «Dowex 1X4» (20—50 меш), уравновешенную 50 мМ трис-HCl буфером, рН 7,8. Размеры колонки в случае использования 50 мг лецитина составляют 1x7 см. Выход липосом с колонки регистрируют по мутности вытекающего раствора, содержащего везикулы.

б. Метод быстрого этанольного разведения. Эта-нольный раствор лецитина, содержащий 20—40 мкмоль фосфолипида, быстро вводится с помощью шприца в 0,16 М раствор КО до максимальной концентрации этанола — 7,5%. С целью концентрирования гомогенной популяции липосом, а также для удаления этанола суспензию полученных липосом центрифугируют при 150 000 g в течение 1 ч.

Осадок липосом суспендируют

Липосомы, полученные указанными методами, представляют собой бислойные, униламеллярные, сферической формы везикулы диаметром 25—30 нм. Препараты липосом хранят в атмосфере азота или аргона при —20 °С в течение 1 мес. Перед использованием препарата определяют, возможно ли в нем перекисное окисление фосфолипида. С этой целью на спектрофотометре оценивают индекс окисленности, т. е. отношение поглощения суспензии липосом (2 мкмоль лецитина в 3 мл смеси этанол—эфир в соотношении 3:1) при 233 и 215 нм. Поглощение препарата липосом при 233 нм свидетельствует о присутствии в суспензии продуктов перекисного окисления лецитина. В работе используют препараты липосом, индекс окисленности которых не превышает 0,4.

Адсорбция гексокиназы на фосфолипидных мембранах (липосомах). Адсорбцию (иммобилизацию) гексокиназы на лцпосомах проводят сус-пендированием препарата липосом (

страница 190
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Кликните, получите скидку на заказ с промокодом "Галактика" - ноутбук HP - федеральный супермаркет компьютерной техники.
бокалы для белого вина купить
mitre squad
Кувшины Sinfonia

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.01.2017)