химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

мМ), ионов

Са2^ (0,5—1,0 мМ) и Mg2^ (1,0—10,0 мМ) на температурные зависимости флуоресценции ФИТЦ, АНС и пирена.

ЛИТЕРАТУРА

1. Транспортные аденозинтрифосфатазы. Современные методы исследования/Под ред. А. А. Болдырева. М., 1977.

2. Болдырев А. А., Л о п и н а О. Д., Рубцов А. М. и др. Биохимия активного транспорта ионов и транспортные АТФазы. М., 1983.

3 Л а к о в и ч Дж. Основы флуоресцентной спектроскопии. М., 1986.

4. Владимиров Ю. А., Добрецов Г. Е. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М., 1980.

5. Рубцов А. М. Влияние субстратов Са—АТФазы на кинетические свойства SH-группы саркоплазм этического ретикулума//Биохимия, 1982. Т. 47, № 6. С. 1046.

6 Бессонов В. А, Болдырев А. А., Ко Чже Чжунидр. Na, К-АТФаза: температурная зависимость активности при гидролизе разных субстратов//Вестн. Моск. ун-та. Сер. биол. 1977. № 4. С. 17.

3674

2. ИЗУЧЕНИЕ ПРОЦЕССОВ АКТИВАЦИИ АДЕНИЛАТЦИКЛАЗЫ4

Аденилатциклаза (КФ 4.6.1.1) эукариот является ферментом плазматических мембран. Она катализирует реакцию образования цАМФ из АТФ. Фермент состоит из трех компонентов: рецептора к гормону, ГТФ-связывающего белка (N-белка) и каталитической субд>единицы. Гормональная активация аденилатциклазы осуществляется в результате следующих взаимодействий компонентов. Гормон, связываясь с рецептором, индуцирует образование тройного комплекса: гормон — рецептор — N-белок. Связывание ГТФ с N-белком вызывает диссоциацию тройного комплекса с образованием активированного N-белка. Активированный N-белок, содержащий ГТФ, взаимодействует с каталитической субъединицей фермента, увеличивая ее активность. Гидролиз ГТФ до ГДФ и неорганического фосфата ГТФазой N-белка приводит к диссоциации комплекса N-белка с каталитической субъединицей и «выключению» фермента:

Н.ГТФ

R-f-N (ГДФ) " HR • N (ГТФ) -" HR + N* (ГТФ),

N* (ГТФ) + С N* (ГТФ) • С* N (ГДФ) + С,

где Н — гормон, R — рецептор к гормону, N, N* — неактивная и активированная формы N-белка, С, С* — неактивная и активная каталитические субъединицы аденилатциклазы.

Таким образом, измеряемая активность аденилатциклазы зависит от скорости активации N-белка и скорости гидролиза ГТФ.

Целью работы является изучение процесса активации аденилатциклазы из печени крысы гормонами и гуаниловыми нуклеотидами.

Реактивы:

1. Среда выделения: 10 мМ трис—НС1, рН 7,5, 5 мМ MgCl2, 1мМ ЭДТА, 1 мМ дитиотреитол, 0,25 М сахароза.

2. Среда выделения без сахарозы.

3. Трис-HCl — 500 мМ раствор, рН 7,5, содержащий 1 мМ цАМФ.

4. MgCl2 — 50 мМ раствор.

5. АТФ — 1 мМ раствор, содержащий 10 мМ дитиотреитол.

6. Креатинфосфат — 100 мМ раствор, содержащий 4 мг/мл креа-тинфосфокиназы.

7. Имидазол — 1,5 М раствор.

8. Гуанилилимидодифосфат — 1 мМ раствор.

9. Изопротеренол — 1 мМ раствор.

10. Среда R (общий объем 25 мкл, готовить непосредственно перед определением активности): по 5 мкл растворов (3)—(6), [а—32Р] АТФ (500 000 имп/мин).

4 Работа предложена Скуратом А. В.

Получение мембранного препарата аденилатциклазы. Кяшицу печеночной ткани (приготовление см. на с. 65) в количестве 100 г помещают в гомогенизатор MPW302, добавляют 90 мл среды выделения и гомогенизируют в течение 3 мин при максимальной скорости. Стакан гомогенизатора охлаждают во льду. Гомогенат фильтруют через 2 слоя марли и центрифугируют 10 мин при 500 g. Осадок отбрасывают, супернатант центрифугируют 20 мин при 10 000 g. Полученный осадок суспендируют в 90 мл среды выделения, не содержащей сахарозы, Е центрифугируют так же. Полученную фракцию клеточных мембран суспендируют в среде выделения без сахарозы и MgCl2 до концентрации белка 4 мг/мл.

Определение активности аденилатциклазы. Реакцию начинают внесением в среду R (объема 25 мкл) препарата аденилатциклазы, содержащего 40—80 мкг белка, и измеряют количество цАМФ в объеме.

50 мкл, образующегося при 30 °С. Реакцию останавливают добавлением 200 мкл 0,5 н. НС1. Пробирки кипятят на водяной бане в течение

6 мин и сразу после этого нейтрализуют содержимое 200 мкл 1,5 М

имидазола. 4

В условиях мягкого кислотного гидролиза цАМФ не разрушается, тогда как АТФ теряет фосфатную часть молекулы, и вся радиоактивность [а—32Р] АТФ, не включенная в цАМФ, переводится в неорганический фосфат. Это позволяет отделить цАМФ от фосфата путем избирательной сорбции фосфата на окиси алюминия.

Содержимое пробирок (450 мкл) наносят на стеклянные колонки размером 1X6 см, заполненные 1 г сухой окиси алюминия. цАМФ элюируют пятью миллилитрами воды в сцинтилляционные флаконы. Счет радиоактивности проводят по Черенкову на жидкостно-сцинтилляцион-ном счетчике в тритиевом канале.

Изучение регуляции аденилатциклазы гормонами и гуаниловыми нуклеотидами. При изучении влияния! гуаниловых нуклеотидов и кате-холаминов на активность аденилатциклазы (АЦ) реакцию проводят в пробах объемом 50 мкл. Для определения зависимости активности фермента от концентрации гуанилилимидодифосфата (ГИДФ) в пробирки вносят по 20 мкл смеси R, 5 мкл воды и 5 мкл ГИДФ (10~7— Ю-4 М)

страница 186
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
работодатель подал иск на возмещение ущерба что делать
где бнсплатно пройти компьютерные курсы
картина в подарок
Выгодное предложение от интернет-магазина KNSneva.ru на T9S66EA - корпоративные поставки в Санкт-Петербург.

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)