химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

сцентной меткой проводят в среде, содержащей 0,25 М сахарозу, 100 мкМ ЭГТА и 50 мМ имидазол (рН 8,0). В пробу объемом 5 мл вносят ФИТЦ до конечной концентрации 50 мкМ и белок CP до концентрации 2—3 мг/мл, после чего инкубируют 15 мин при комнатной температуре при постоянном перемешивании на магнитной мешалке. После инкубации пробу разводят раствором того же состава до объема 40 мл и центрифугируют 60 мин при 45 000 g. Полученный осадок суспендируют в среде, содержащей 100 мМ КО, 100 мкМ ЭГТА и 50 мМ имидазол (рН 7,5), до концентрации белка 5—10 мг/мл. Измерение флуоресценции проводят в той же среде при концентрации белка в пробе объемом 3 мл 0,3—0,5 мг/мл.

После получения меченных ФИТЦ препаратов CP определяют количество включенной метки. Для этого измеряют оптическую плотность образца, содержащего модифицированный белок, при 490 нм н рассчитывают концентрацию ФИТЦ, используя коэффициент молярной экстинкции метки, равный 64-103 М-1 см-1. Для учета вклада светорассеивания в качестве контроля используют раствор везикул CP той же концентрации по белку, но не обработанных ФИТЦ. После этого рассчитывают включение метки в белок Са—АТФазы, зная, что молекулярный вес фермента равен 100 000, а содержание белка Са— АТФазы в препаратах легкой фракции CP составляет —80%. Для приведенных условий обработки включение метки составляет 1 моль/моль Са—АТФазы.

АНС — флуоресцентный зонд, нековалентно связывающийся с белками и неполярными областями мембран. При связывании АНС с белками или мембранами его флуоресценция значительно возрастает, так как квантовый выход флуоресценции АНС зависит от полярности его окружения и увеличивается в гидрофобных средах. Максимум возбуждения АНС — 360 нм, максимум флуоресценции — 460—480 нм (в зависимости от полярности микроокружения). При работе с препаратами CP измерение флуоресценции проводят в среде, содержащей 100 мМ КС1, 0,5 мМ ЭГТА и 50 мМ имидазол, рН 7,0. Концентрация белка CP в кювете — 0,3—0,5 мг/мл, концентрация АНС — от 5 до 75 мкМ (в зависимости от чувствительности прибора и поставленной задачи).

Пирен — гидрофобный флуоресцентный зонд, способный встраиваться в неполярные области между жирнокислотными цепями фосфот липидов бислоя мембран. При этом в спектре флуоресценции пирена, встроенного в мембрану, обнаруживаются 3 пика (в области 370'— 390 нм), характерные для мономерной формы пирена, и один пик (в области 460—470 нм), характерный для эксимера пирена — димера, состоящего из одной возбужденной и одной невозбужденной молекулы зонда. Максимум возбуждения пирена — 330—335 нм. Величина пика флуоресценции эксимера характеризует способность молекул зонда

взаимодействовать друг с другом в гидрофобной сердцевине мембраны, что определяется двумя взаимосвязанными факторами — плотностью упаковки углеводородных цепей липидов и гидрофобным объемом мембраны. Обычно исследуется степень зксимеризации пирена, т. е. соотношение интенсивной флуоресценции эксимерной и мономерной форм зонда, которое характеризует микровязкость гидрофобных областей мембраны. При работе на фотоколориметре «Spekol-10» удается регистрировать только флуоресценцию эксимерной формы пирена, однако при наличии соответствующих светофильтров можно попытаться вычленить по отдельности пики мономерной и эксимерной форм. При работе с препаратами CP флуоресценцию пирена измеряют в среде, содержащей 100 мМ КС1, 0,5 мМ ЭГТА, 50 мМ имидазол а, рН 7,5, 0,25 мг/мл белка CP и 25 мкМ. пирена. После добавления пирена пробу инкубируют 5—10 мин для более полного встраивания зонда в мембрану.

Температурную зависимость флуоресценции меток и зондов измеряют в приборах с термостатируемым кюветным отделением, изменяя температуру от 5 до 40° С со скоростью 2—3°С в мин. В отсутствие приборов такого класса можно инкубировать пробы непосредственно в кюветах, термостате, а измерение флуоресценции проводить по возможности быстро, в течение 1—1,5\ мин.

При работе с препаратами CP рекомендуется выполнить следующие задачи: >

а) определить параметры связывания АНС с мембранами CP в

разных условиях. Для этого в пробу, содержащую все необходимые

компоненты и белок, вносят AI^IC небольшими порциями так, чтобы

его концентрация изменялась от\5 до 75 мкМ; после каждой добавки

АНС измеряют интенсивность флуоресценции и после окончания эксперимента строят график зависимости \fF, где F — интенсивность флуоресценции, от 1/[АНС]; с помощью данного графика рассчитывают

максимальную флуоресценцию и кажущееся значение К'д для АНС;

исследуют влияние рН (от 6,0 до 8,0), ионов Са2+ (0,5—1,0 мМ), Mg2+

(1 —10 мМ), АТФ (3 мМ) на значение /С'д и максимальной флуоресценции АНС;

б) исследовать температурную зависимость флуоресценции ФИТЦ,

АНС и пирена в мембранах CP, регистрируя точки перегибов на графиках Аррениуса для флуоресценции (\gF от 1/7); сравнить положения точек перегибов на графиках Аррениуса для флуоресцентных меток и зондов с положением точки перегиба на графике Аррениуса для

Са—АТФазной активности; исследовать влияние АТФ (3

страница 185
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
обувь для пляжа и бассейна в саратове
промывка радиатора кондиционера автомобиля цена
образовательный центр лубянка курсы дизайна интерьера
эксклюзив курсы кройки и шитья

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(02.12.2016)