химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ствии лиганда в концентрации [L]. Таким образом, график зависимости lg (Л) от времени в присутствии определенной концентрации лиганда [L] представляет собой прямую с наклоном kill +,[Ь]//С/Д, а значение К\ можно определить по углу наклона прямой на графике зависимости kjkfi от [Lj. Более подробно вывод настоящего уравнения описан в статье А. М. Рубцова (см. с. 367, п. 5).

Исследование температурных зависимостей активности Са— АТФазы и MG—АТФазы; расчет энергии активации

Реактивы:

реактивы для определения активности Са—АТФазы 'и Mg— АТФазы (с. 359).

Исследование температурных зависимостей мембранных ферментов позволяет в ряде случаев оценить влияние состояния липидной фазы мембран на их функционирование. Для этого измеряют активность ферментов при разных температурах, выражая полученные результаты в виде графика Аррениуса (график зависимости логарифма и активности фермента от 1/Т). Вид получаемого графика (линейный или нелинейный с перегибом в определенной области температур) позволяет делать заключения о наличии термоиндуцированных изменений в функционировании фермента.

Для данной работы можно использовать прибор «Термоград-1», изготовленный на кафедре биохимии биологического факультета МГУ (описание прибора см. в работе (6) списка литературы). Прибор представляет собой дюралюминиевый блок с отверстиями для пробирок (16 рядов по 6 отверстий в каждом). При нагревании одного конца блока регулируемыми нагревателями и охлаждении другого конца с помощью холодильного агрегата получают устойчивый градиент температур от 6 до 38 °С. Число проб, помещаемых в блок одновременно, достаточно для получения параллельных проб при каждой температуре и для контроля неферментативного расщепления субстрата за время реакции.

Для получения графика температурной зависимости активности Са—АТФазы определяют линейность ферментативной реакции во вреМСН И При. ППОППЛ, \^JJ V.,U,liJciyv JTl buivv^.m ^w.-.-. — j r _„ .. „ 1 l

инкубации, исходя из полученных данных. Так как рН буферных растворов изменяется с изменением температуры, особое внимание обращается на контроль рН используемой среды инкубации. Определение активности Са—АТФазы целесообразно проводить во всем диапазоне температур одновременно.

При работе с препаратами CP рекомендуется поставить следующие эксперименты:

а) сравнить температурные характеристики Са- и Mg-зависимой

АТФаз в координатах Аррениуса (lg А от 1/7);

б) исследовать влияние детергентов (тритон Х-100, додецилсульфат Na в концентрациях 0,1—1 мг/мл) на температурную зависимость

? а—АТФазы CP;

в) рассчитать энергию активации Са—АТФазы в области низких

я высоких температур; энергия активации рассчитывается по формуле:

2,303R(lgATt~lgATi) Тг ~ Тг

где Еа — кажущаяся энергия активации; ATl—Аг2— удельная активность фермента при температурах Ti и 7У, R — универсальная газовая постоянная, равная 1,987 кал/моль-град.

Исследование температурных зависимостей флуоресценции меток и зондов, связанных с мембранами саркоплазматического ретикулума

Реактивы:

1. Сахароза — 1 М раствор.

2. ЭГТА — 10 мМ раствор.

3. Имидазол — 300 мМ раствор, рН 7,0, а также рН 7,5 и 8,0.

4. КО — 1 М раствор.

5. СаС12 — 5 мМ раствор.

6. АТФ — 30 мМ раствор.

7. Флуоресцеинизотиоцианат (ФИТЦ) — 100 мМ раствор в диме-тилформамиде, готовится непосредственно перед употреблением,

8. 1-Анилин-8-нафталин-сульфоновая кислота (АНС) — 5 мМ водный раствор.

9. Пирен — 10 мМ раствор в этиловом спирте.

Флуоресцентные зонды и метки являются удобным инструментом для исследования биологических мембран и мембранных ферментов. Использование зондов разной природы, способных связываться с белками или встраиваться в различные области липидного бислоя, а также меток, ковалентно реагирующих с функциональными группами белков или липидов, позволяет получить ценную информацию о состоянии и подвижности белка в мембране, состоянии липидного матрикса, характере белок-белковых и белок-липидных взаимодействий.

Для измерения флуоресценции используют специально предназначенные для этой цели флуоресцентные спектрофотометры, позволяющие с помощью монохроматоров задавать длины волн для возбуждающего и испускаемого света. Испускаемый флуорофором свет обычно регистрируют под углом 90° к падающему свету. В отсутствие флу~

„KV^„,nv,.yj mciiipuvpuiuiaeipa для раооты можно использовать фотоколориметр «Spekol-Ю» (ГДР) с приставкой для измерения флуоресценции. В этом случае длина волны возбуждающего света задается монохроматором прибора, а испускаемый свет проходит через специально подбираемый фильтр, который не пропускает возбуждающий свет, но пропускает испускаемый. Рекомендуемые в настоящей методике флуоресцентные зонды и метки обладают достаточно высоким квантовым выходом, что позволяет работать с ними на колориметре «Spekol-10».

ФИТЦ — флуоресцентная метка, ковалентно модифицирующая аминогруппы белка. Максимум возбуждения ФИТЦ — 490—495 нм, максимум флуоресценции — 525 нм. Обработку препаратов Са—АТФазы данной флуоре

страница 184
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
GreenPan CW0000407
ортопедическая подушка купить в
сетки футбольные купить
ремонт промышленного чилера москва

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(25.05.2017)