химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

тов, ионов-активаторов, аллостерических модификаторов, детергентов, при изменении температуры и т. д.

При работе с мембранными препаратами Са—АТФазы CP целесообразно поставить следующие эксперименты:

а) проанализировать влияние (по сравнению с контролем) на кинетические параметры SH-групп Са—АТФазы ионов Са2+ в концентрации от 0,5 до 1,0 мМ и ионов Mg2+ в концентрации от 1 до 10 мМ (состав среды инкубации контрольной пробы приведен выше);

б) проанализировать влияние на кинетические параметры SH-групп

субстратов Са—АТФазы. CP: АТФ — в концентрации от 100 мкМ до

3 мМ и ГТФ, ЦТФ, УТФ, ИТФ — в концентрации 1—3 мМ; сравнить

влияние разных субстратов на конформационное состояние Са—АТФазы; оценить влияние двухвалентных катионов на проявление эффекта субстратов, вводя в среду инкубации Са2+ (до 1 мМ) или Mg2*

(до 3 мМ);

в) оценить влияние на конформационное состояние Са—АТФазы

неионного детергента тритона Х-100 в концентрациях 0,1—1 мг/мл и

ионного детергента додецилсульфата Na в концентрациях 0,1 — 1 мг/мл;

исследовать влияние двухвалентных катионов Са2+ и Mg2+ и субстратов

(АТФ, ГТФ и др.) на кинетические свойства SH-групп фермента в

присутствии детергентов;

г) проанализировать влияние на кинетические параметры SHгрупп изменения температуры в диапазоне от 10 до 45 °С.

Предлагаемая схема постановки эксперимента позволяет исследовать также влияние на конформационное состояние мембранного фермента Са—АТФазы различных мембранотропных соединений — локальных анестетиков, фармакологических агентов, органических растворителей и т. п.

Анализ инактивации Са—АТФазы ретикулума НБД-хлоридом и определение константы скорости инактивации фермента

Реактивы:

1. Реактивы для модификации SH-групп фермента НБД-хлоридом.

2. Реактивы для определения активности Са—АТФазы.

3. Реактивы для определения неорганического фосфата по методу Ратбуна и Бетлах (с. 36).

Для определения константы скорости инактивации Са—АТФазы НБД-хлоридом проводят модификацию SH-групп в той же среде, которая используется для определения кинетических характеристик SH-rpynn (с. 360). Реакцию начинают добавлением НБД-хлорида. По ходу реакции каждые 0,5—5 мин в зависимости от условий реакции отбирают аликвоты объемом 20—50 мкл и вносят их в 1 мл среды для определения активности Са—АТФазы (с. 359). Пробы инкубируют 1 — 2 мин при 25 или 37 "С, определив заранее линейность реакции во времени, после чего останавливают реакцию добавлением 1 мл 3 М ацетатного буфера (рН 4,3). Образующийся неорганический фосфат определяют методом Ратбуна и Бетлах (с. 36). Объем отбираемой пробы и время инкубации при определении активности подбирают заранее Ингибирующим действием НБД-хлорида в ходе измерения активности фермента можно пренебречь, учитывая разведение ингибитора и высокую концентрацию АТФ в среде инкубации.

После определения активности стлоят график, отражающий зависимость скорости гидролиза АТФ от времени модификации препарата CP НБД-хлоридом, в полулогарифмических координатах. Если полученные экспериментальные точки лежат на одной прямой, реакцию инактивации можно считать реакцией псевдопервого порядка. Константу скорости инактивации рассчитывают так же, как константы скорости модификации SH-групп (с. 361).

При исследовании влияния различных веществ на скорость инактивации С а—АТФазы их вносят в среду для модификации SH-групп в нужных концентрациях (с. 360),

Поскольку препараты CP обладают не только Са-зависимой, но и Mg-зависимой АТФазной активностью, необходимо помимо общей АТФазной активности в соответствующие моменты времени определить Mg-зависимую АТФазную активность, которая измеряется в отсутствие добавки в среду инкубации СаС12. Активность Са-АТФазы рассчитывается как разность между общей и Mg-зависимой активностью.

Расчет значений кажущихся констант диссоциации для лигандов, обеспечивающих защиту Са—АТФазы от инактивации НБД-хлоридом

Измерение констант скорости инактивации Са—АТФазы НБД-хлоридом в присутствии разных концентраций лигандов (например, АТФ или АДФ) проводят, как описано выше. Расчет значений К'я возможен по схеме реакции инактивации, согласно которой с ингибитором может взаимодействовать фермент, свободный от лиганда (схема справедлива в случае Са—АТФазы и НБД-хлорида);

E + L——д—->-EL

?<—?—

h

НБД-хлорид Е-НБД

Здесь Е — Са—АТФаза, L — лиганда (АТФ или АДФ); /С'д — кажущаяся константа диссоциации комплекса фермент — лиганд (EL), а

ki — константа скорости инактивации фермента. Считая, что скорость

образования комплекса EL значительно выше скорости инактивации

фермента, убыль немодифицированной формы фермента можно описать

следующим уравнением: *

&l LECAJ =

it *1 C3J [L]

1 +

Так как количество ^модифицированного фермента пропорционально его активности (А), уравнение можно преобразовать следующим образом:

dA _ МА) К __.>

1 ~г 1 "Г

*д *д

где kt — константа скорости инактивации фермента в отсутствие лиганда, a k't — константа скорости инактивации фермента в присут

страница 183
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
Dell Inspiron 5475-3464
http://taxiru.ru/shashki-dlya-taxi-all/shashki-do-45-sm/
такси бизнес класс в аэропорт
Прямые комоды с 5 ящиками купить

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(20.10.2017)