химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

~ 50-кратный избыток тио-лового реагента по отношению к SH-группам белка. В контрольную пробу вносят все компоненты, за исключением белка СР. Реакцию начинают добавлением НБД-хлорида,

За ходом реакции следят, регистрируя увеличение оптической плотности при 420 нм — в максимуме поглощения S—НБД-производ-ного (коэффициент молярной экстинкции для S—НБД-производного составляет 13-Ю3 М~' см"1). В ходе реакции в некоторых условиях изменяется мутность суспензии CP, что приводит к увеличению свето-рассеивания. Для учета вклада светорассеивания в увеличение оптической плотности образца необходимо регистрировать оптическую плотность при другой длине волны, например при 550 или 600 нм, где не наблюдается поглощения S—НБД-производного. До начала реакции регистрируют оптическую плотность при 420 и 550 нм, после чего находят соотношение оптических плотностей при этих длинах волн. Известно, что величина светорассеивания зависит от длины волны, причем

где Ei и Еч — величины оптической плотности при длинах волн \х и %ч соответственно. Показатель степени п определяется свойствами везикул CP: их величиной, формой и т. д Зная соотношение величин оптической плотности пробы при 420 и 550 нм до начала реакции и определив оптическую плотность при 550 нм в ходе реакции, можно рассчитать величину вклада светорассеивания в значение оптической плотности при 420 нм в любой момент времени. Вычитая из значения оптической плотности при 420 нм рассчитанное значение оптической плотности, обеспечиваемое светорассеиванием, получают величину, характеризующую поглощение образующего S—НБД-производною

Значения оптической плотности регистрируют каждые 2—3 мин после начала реакции в течение 60—90 мин. Для работы желательно использовать спектрофотометр, позволяющий работать в автоматическом режиме. Максимальную величину оптической плотности рассчитывают по формуле:

р. Щ, ЕаЕс

•С ос

2Еь — (Яа -г Ес)'

где Еа, Еь и Ес — значения оптической плотности при 420 нм в моменты времени ta, tb, tc соответственно, причем tb—ta—tc—tb, a tb—ta примерно соответствует времени, за которое реакция протекает наполовину.

Поскольку в опытах используется большой избыток НБД-хлорида

по отношению к SH-группам белка, процесс их модификации можно

рассматривать как реакцию псевдопервого порядка, пренебрегая изменением концентрации НБД-хлорида в ходе реакции При наличии более чем одного кинетического типа ^Н-групп в исследуемых препаратах

скорость убыли непрореагировавших4 трупп описывается следующим

уравнением: \^

E~-Et = ? (E^-Etl) = Yt {Е^е-%

где Еж к Et — значения оптической плотности в конце реакции и в момент времени t соответственно; Е^ и Ей — значения оптической плотности в конце реакции и в момент времени t для каждого индивидуального кинетического типа SH-групп; kt — константа скорости реакции псевдопервого порядка для модификации SH-групп этого кинетического типа.

Для определения числа типов SH-групп, их количества и кинетических характеристик строят график зависимости lg^oo—Et) от времени. Если получаемая зависимость нелинейна, то конечный линейный участок графика продолжают до пересечения с осью ординат и из величины отсекаемого на этой оси отрезка рассчитывают количество SH-rpynn данного, самого медленного типа. Константу скорости модификации SH-групп этого типа рассчитывают по формуле, 2,303 - А0

где Ло—Еоо, a At — Еоо—Et. Затем из экспериментальных точек на графике зависимости lg(-Ј"oo—Et) от времени вычитают прямую, характеризующую модификацию самых медленных групп, и откладывают полученные значения на том же графике. Если полученная таким образом зависимость не является линейной, процедуру графического вычитания конечного линейного участка графика продолжают до тех пор, пока в результате вычитания на графике не получится прямая линия. Каждую прямую, характеризующую модификацию SH-групп определенного кинетического типа, анализируют описанным выше способом, рассчитывая количество SH-групп и константу скорости их модификации.

В препаратах CP в описанных выше условиях с помощью НБД-хлорида удается обычно выявить 8—10 молей SH-групп в расчете на 105 г белка, которые принадлежат к двум кинетическим типам. Скорость модификации SH-групп данных типов различается примерно в 10 раз, что позволяет достаточно четко разделить их графически.

Исследование влияния субстратов АТФазной реакции и детергентов на кинетические характеристики SH-групп

Реактивы:

1. К.С1 — 1 М раствор.

2. ЭГТА — 10 мМ раствор.

3. Имидазол — 300 мМ раствор, рН 7,0.

4. АТФ (а также ЦТФ, ГТФ, УТФ, ИТФ) — 50 мМ раствор.

5. СаС12 — 10 мМ раствор.

6. MgCl2 — 50 мМ раствор.

7. Тритон Х-100 — раствор 10 мг/мл.

8. Додецилсульфат Na — раствор 10 мг/мл.

9. НБД-хлорид — 50 мМ раствор в этиловом спирте, готовится непосредственно перед употреблением.

Кинетические характеристики SH-групп белка и их изменение под влиянием различных воздействий позволяют анализировать изменения конформации белковой молекулы, которые происходят при связывании субстра

страница 182
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
анализ кала севастопольская
ремонт чиллера расценки
купить мебельные ручки в москве в наличии
обучение по вентиляционным системам

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(22.10.2017)