химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

улума достигает 80—90%; выделяемые препараты CP стабильны при хранении и имеют постоянный белковый и фосфолипидный состав. Цель работы — знакомство с методическими подходами к изучению взаимодействия мембранных ферментов с субстратами и регуляторами, к анализу конформационной подвижности мембранных белков, а также характера и роли белок-липидных взаимодействий в биологических мембранах.

Выделение препаратов легкой фракции саркоплазматического ретикулума из скелетных мышц кролика

Реактивы:

1. Раствор А — сахароза 0,3 М, гистидин 10 мМ, рН 7,7.

2. Раствор Б — КС1 0,6 М, бычий сывороточный альбумин — 0,6 мг/мл; гистидин 5 мМ, рН 7,2.

3. Раствор В (среда хранения) — сахароза 1 М, имидазол 25 мМ, рН 7,0 (5 мл).

Измельченную в мясорубке мышечную массу в количестве 100 г (получение см. с. 221) помещают в 4-кратный объем раствора А и гомогенизируют в ножевом гомогенизаторе (тип. 302, ПНР) 4 раза по 1 мин с одноминутными интервалами при 10 000 об/мин. Все операции проводят на холоде. Полученный гомогенат центрифугируют 20 мин при 12 000g, осадок отбрасывают. Супернатант фильтруют через б слоев марли и центрифугируют 60 мин при 45 ООО g. Супернатант сливают, осадок суспендируют в растворе Б в гомогенизаторе Поттера (стекло, тефлон) до получения однородной суспензии. Полученную суспензию везикул инкубируют 60 мин при постоянном перемешивании на магнитной мешалке при 0 °С (обработка раствором высокой ионной силы необходима для экстракции актомиозинового комплекса), после чего центрифугируют 20 мин при 15 000 g. Осадок отбрасывают, супернатант центрифугируют 60 мин при 45 000g. Полученный осадок, представляющий собой легкую фракцию везикул CP, суспендируют в растворе В до конечной концентрации 20—30 мг/мл. Выход белка CP составляет 1,5—2 мг/г ткани. Суспензию везикул разливают небольшими порциями по 0,3—0,5 мл в пластиковые пробирки и хранят при —20 °С. В таком виде препараты CP хранятся в течение 2—3 мес без потери АТФазной активности.

Концентрацию белка определяют методом Лоури, растворяя везикулы CP в 1%-ном растворе дезоксихолата Na.

Получение ЭДТА-обработанных препаратов саркоплазматического ретикулума с высокой проницаемостью для кальция

Реактивы:

1. Раствор'А — ЭДТА 1 мМ, КО 100 мМ, MgCI2 0,1 мМ, гистидин 10 мМ, рН 8,5 при 0°С (50 мл).

2. Раствор Б (среда хранения) сахароза 1 М, имидазол 25 мМ, рН 7,0 (5 мл).

Фрагменты CP, полученные методом дифференциального центрифугирования (см. выше), суспендируют в растворе А до конечной концентрации белка 0,5—1 мг/мл. Суспензию выдерживают в течение 60 мин на льду при постоянном перемешивании на магнитной мешалке, после чего центрифугируют 60 мин при 45 000 g. Полученный осадок суспендируют в растворе Б до конечной концентрации белка 20— 30 мг/мл. Аликвоты замораживают небольшими порциями по 0,3— 0,5 мл в пластиковых пробирках. В таком виде препарат хранится при —20 °С в течение 2—3 мес без потери активности.

Концентрацию белка определяют методом Лоури, растворяя везикулы в 1%-ном растворе дезоксихолата Na.

Определение АТФазной активности по нарастанию содержания в пробе Фн

Реактивы:

1. КО — 1 М раствор.

2. MgCl2 — 50 мМ раствор.

3. СаС12 — 5 мМ раствор.

4. ЭГТА — 5 мМ раствор.

5. Оксалат К — 50 мМ раствор.

6. АТФ — 30 мМ раствор.

7. Имидазол — 300 мМ раствор, рН 7,0.

8. Ацетатный буфер — 3 М раствор, рН 4,3.

9. Реактивы для определения неорганического фосфата по методу Ратбуна и Бетлах (с. 36).

Общую АТФазную активность ЭДТА-обработанных препаратов CP определяют по нарастанию Фн в среде инкубации, содержащей

100 мМ KC1, 5 мМ MgCl2, 3 мМ АТФ, Ю,5 мМ CaCl2, 0,5 мМ ЭДТА if 30 мМ имидазола, рН 7,0. Концентрация свободного Ca2+ в среде в таких условиях составляет ~10 мкМ, что достаточно для полной активации Са-АТФазы. Реакцию начинают добавлением в пробу объемом 1 мл 5—25 мкг белка CP (в зависимости от активности препарата). Время инкубации составляет 0,5—15 мин и подбирается» с учетом линейности реакции во времени. Реакцию останавливают добавлением 1 мл охлажденного 3 М ацетатного буфера (рН 4,3) и определяют неорганический фосфат по методу Ратбуна и Ветлах (с. 36). Активность Mg-АТФазы определяют в той же среде в отсутствие добавки СаС12. Активность Са-АТФазы рассчитывают как разность между общей АТФ-азной активностью и активностью Mg-АТФазы При работе с аккумулирующими Са2+ препаратами CP в среду инкубации вводят 5 мМ ок-салат калия для увеличения емкости везикул.

Определение количества SH-групп и изучение их кинетических характеристик с помощью 7-хлор-4-нитробензо-2-окса-1,3-диазола (Н БД-хлорида)

Реактивы:

1. КС1 — 1 М раствор.

2 ЭГТА — 5 мМ раствор.

3. Имидазол — 300 мМ раствор, рН 7,0.

4 НБД-хлорид — 50 мМ раствор в этиловом спирте, готовится непосредственно перед употреблением.

Реакцию модификации SH-групп Са-АТФазы препаратов ретикулума НБД-хлоридом проводят в среде следующего состава: 100 мМ КС1, 1 мМ ЭГТА, 30 мМ имидазол (рН 7,0), белок CP 0,2—0,3 мг/мл, 0,75 мМ НБД-хлорид, что обеспечивает

страница 181
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
гироскутеры wheely
В КНС всегда выгодно VA2465S-3 - поставщик it товаров и оборудования.
looftlighter отзывы
деревянный стеллаж

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(24.07.2017)