химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

цикла. Фруктозо-1,6-дифосфатаза (?>-фруктозо-1,6-дифосфат-1-фосфогидролаза, КФ 3.1.3.11) катализирует реакцию гидролиза фрук-тозо-1,6-дифосфата с образованием фруктозо-6-фосфата:

фруктозо-1,6-дифосфат+Н20-н|)руктозо-6-фосфат+Фн.

Фермент широко представлен в тканях с выраженным глюконеогене-тическим превращением углеводов, т. е. в печени и почках. Фермент представляет собой тетрамер, для которого характерна ^оперативность при взаимодействии с субстратом, ионом-активатором Mg и некоторыми внутриклеточными метаболитами.

Реактивы:

1. Трис-HCl буфер — 50 мМ раствор, рН 7,5, содержащий 1 мМ ЭДТА.

2. Трис-HCl буфер — 100 мМ раствор, рН 7,5, содержащий 0,02 мМ ЭДТА.

3. Фруктозо-1,6-дифосфат — 3 мМ раствор.

4. MgCl2 — 150 мМ раствор.

5. КС1 — 600 мМ раствор.

6. НАДФ - 7,5 мМ раствор.

7. Гексозо-б-фосфатизомераза — коммерческий препарат (разводят перед использованием 100 мМ трис-HCl буфером, рН 7,5, до конечной концентрации 60 инт. ед./мл).

8. Дегидрогеназа глюкозо-6-фосфата — коммерческий препарат (разводят перед использованием 100 мМ трис-HCl буфером, рН 7,5, до конечной концентрации 60 инт. ед./мл).

9. АМФ — 15 мМ раствор.

10. ГМФ — 6 мМ раствор.

11. Аденин — 6 мМ раствор.

12. Калий фосфорнокислый — 30 мМ раствор.

13. Цитрат натрия — 100 мМ раствор. х

Получение растворимой клеточной фракции печени крысы. Все

процедуры по получению клеточной фракции проводят при 0°С.

Среда выделения: 50 мМ трис-HCl буфер, рН 7,5, содержащий 1 мМ ЭДТА.

Тканевую кашицу (приготовление см. на с. 65) взвешивают и переносят в стакан гомогенизатора Поттера. Добавляют среду выделения из расчета 5 мл среды на 1 г ткани и гомогенизируют в течение 30 с с помощью тефлонового пестика без нарезки. Полученный гомогенат центрифугируют при 20 000 g в течение 15 мин. Супернатант представляет собой 16%-ную растворимую клеточную фракцию. Препарат фильтруют через 4 слоя марли и хранят порциями при —5°С в течение 2 нед. Размораживание растворимой клеточной фракции проводят при комнатной температуре.

Определение активности фруктозо-1,6-дифосфатазы. Активность фермента определяют энзиматическим методом по количеству образовавшегося фруктозо-6-фосфата. Метод основан на использовании системы двойного ферментного сопряжения с участием глюкозо-6-фос-фатизомеразы и дегидрогеназы глюкозо-6-фосфата согласно схеме:

изомераза с i_ дегидрогеназа

фруктозо-6-фосфат >- глюкозо-6-фосфат

НАДФ НАДФН

За ходом реакции следят на спектрофотометре по увеличению оптической плотности при 340 нм в результате восстановления НАДФ.

Состав реакционной среды объемом 3 мл: 100 мМ трис-HCl буфер, рН 7,5, содержащий 0,02 мМ ЭДТА; MgCl2 5 мМ; фруктозо-1,6-дифосфат — 100 мкМ; КС1—100 мМ; НАДФ —0,25 мМ; глюкозо-6фосфатизомераза и дегидрогеназа глюкозо-6-фосфата по 1 инт. ед. в пробе; растворимая клеточная фракция 25—100 мкл. Контрольна» проба не содержит MgCb. Реакцию начинают добавлением ферментного препарата. Показания прибора регистрируют каждые 30 с в течение 3 мин.

Расчет активности фермента проводят на основании величин начальной скорости реакции при условии наличия прямой пропорциональной зависимости скорости реакции от количества ферментного-препарата в пробе. Активность фермента выражают в микромолях восстановленного НАДФ за 1 мин на 1 г ткани.

Изучение регуляторных свойств фермента

1. Определяют активность фруктозо-1,6-дифосфатазы в свежевыде-ленной клеточной фракции и после хранения препарата при —5°С.

2. Изучают зависимость скорости реакции от концентрации фрук-тозо-1,6-дифосфата в диапазоне концентраций субстрата 2-10-5— 3-Ю-4 М. Отмечают факт субстратного торможения реакции при высоких концентрациях субстрата. Анализируя начальный участок графика зависимости скорости реакции от концентрации субстрата, оценивают 50,5 как значение концентрации фруктозо-1,6-дифосфата, при которой скорость реакции достигает половины максимальной величины.

lgx

Оценивают меру кооперативности при взаимодействии фермента с субстратом в низких концентрациях, исследуя полученную зависимость в координатах Силоновой—Курганова (с. 335) для случая, когда скорость реакции в отсутствие эффектора равна 0. Рассчитывают значение коэффициента кооперативности q по формуле:

q =

где vh v2, и3 — скорости реакции при концентрации субстрата Si3. Исследуют влияние АМФ на активность фруктозо-1,6-дифосфатазы в диапазоне концентраций эффектора от 10 до 100 мМ. Разностным методом Силоновой—Курганова оценивают степень кооперативности (q), проявляемую ферментом по данному ингибитору (с. 335).

В целях оценки специфичности ингибирующего действия АМФ на фермент исследуют влияние на активность фруктозодифосфатазы структурного аналога АМФ—ГМФ, а также структурных компонентов молекулы АМФ—аденина и Фн, взятых в концентрациях 100 мкМ и: 1 мМ.

4. Изучают влияние аллостерического активатора Mg2+ на активность фруктозодифосфатазы в диапазоне концентраций MgCl2 0,1— 8 мМ. С целью оценки меры кооперативности по активатору рассчитывают знач

страница 179
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
опытный адвокат по разделу имущества москва
серые линзы для карих глаз итнетнет магазин
Двухтопливные котлы Buderus SK755 1850
Сковорода Protect Alux Premium 26 см с антипригарным покрытием глубокая

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(04.12.2016)