химический каталог




Практикум по биохимии

Автор С.Е.Северин, Г.А.Соловьева

ы. Кроме того, в работе исследуется внутримитохондриальная локализация фермента.

Реактивы:

1. К-фосфатный буфер — 100 мМ раствор, рН 6,5—7,5.

2. Трис-HCl буфер - 100 мМ раствор, рН 7,2-9,0.

3. Сахароза — 0,25 М раствор, приготовленный на 100 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,5.

4. L-аспарагиновая кислота — 0,3 М раствор, нейтрализованный КОН до рН 7,0.

5. а-кетоглутаровая кислота — 50 мМ раствор, нейтрализованный КОН до рН 7,0.

6. НАДН — 3 мМ раствор (свежеприготовленный).

7. Малатдегидрогеназа — коммерческий препарат, разводят перед использованием 100 мМ К-фосфатным буфером, рН 7,5, до конечной концентрации 60 инт. ед./мл.

8. Щавелевоуксусная кислота — 30 мМ раствор, нейтрализованный КОН до рН 7,0.

9. Дигитонин — 2%-ный раствор, свежеприготовленный на 0,25 М сахарозе при нагревании.

10. КО — 1 М раствор, приготовленный на 100 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,5.

11. Реактивы для определения белка микробиуретовым методом в присутствии 1%-ного дезоксихолата натрия.

Получение растворимой клеточной фракции печени крысы. Все

процедуры по получению препаратов аспартатаминотрансферазы проводят при 0°С.

Среда выделения: 0,25 М сахароза, рН 7,5

Навеску (5 г) тканевой кашицы (приготовление смч на с. 65) взвешивают и переносят в стеклянный стакан гомогенизатора Потте-ра. Добавляют среду выделения из расчета 9 мл среды на 1 г ткани и гомогенизируют в течение 30 с с помощью тефлонового пестика без нарезки, Полученный гомогенат центрифугируют при 20 ООО g в течение 15 мин. Супернатант после центрифугирования представляет собой 10%-ную растворимую клеточную фракцию. Препарат фильтруют через 4 слоя марли и хранят порциями при —5°С в течение 2 нед. Размораживание растворимой клеточной фракции проводят при комнатной температуре. Перед определением активности аспартатаминотрансферазы препарат фермента разводят средой выделения до конечного разведения 1:100.

Получение митохондриальной фракции. Тканевый гомогенат центрифугируют при 600g в течение 10 мин для удаления ядер и обломков клеток. Полученный супернатант фильтруют через 4 слоя марли и центрифугируют при 10 000 g в течение 10 мин. Полученный осадок митохондрий промывают средой выделения от примеси растворимой клеточной фракции. С этой целью осадок осторожно суспендируют с помощью пипетки в небольшом объеме среды выделения (митохондрии из 1 г ткани в 0,2 мл среды). Затем суспензию разводят средой выделения в 10 раз и центрифугируют при 10 000 g в течение 10 мин. Полученную фракцию промытых нативных митохондрий окончательно суспендируют в нужной среде из расчета: митохондрии из 1 г ткани в 5 мл среды Фракцию нативных митохондрий (в 0,25 М сахарозе, рН 7,5) хранят при 0°С и используют в день выделения.

Определение активности аспартатаминотрансферазы. Активность фермента определяют энзиматическим методом по количеству образовавшейся щавелевоуксусной кислоты в процессе прямой аминотранс-феразной реакции. Метод основан на использовании сопряженной малатдегидрогеназной реакции согласно схеме:

щавелевоуксусная кислота —^ ^—?->? малат.

НАДН НАД+

За ходом реакции следят на спектрофотометре по уменьшению оптической плотности при 340 нм в результате окисления НАДН. Состав реакционной среды объемом 3 мл: 100 мМ К-фосфатный буфер, рН 7,5; L-аспартат 30 мМ; а-кетоглутарат 5 мМ; НАДН 0,1 мМ; малат-дегидрогеназа 1 инт. ед.; препарат аспартатаминотрансферазы 25— 100 мкл. Контрольная проба не содержит L-аспартат.

Реакцию начинают добавлением ферментного препарата. Показания прибора регистрируют каждые 30 с в течение 3 мин.

Расчет активности фермента проводят на основании величин начальной скорости реакции при условии наличия прямой пропорциональной зависимости скорости реакции от количества ферментного препарата в пробе. Активность фермента выражают в микромолях окисленного НАДН за 1 мин на 1 г ткани.

Определение активности малатдегидрогеназы митохондрий проводят согласно приведенной выше схеме.

uuuue реакционной среоы ооъемом а мл: 1UU ММ ^-фосфатный буфер, рН 7,5; щавелевоуксусная кислота 3 мМ; НАДН 0,1 мМ; препарат митохондриального фермента: 25—200 мкл в пробе

Изучение свойств и локализации фермента

1. Определяют активность аспартатаминотрансферазы в растворимой клеточной фракции печени в день выделения и после хранения.

2. Определяют активность аспартатаминотрансферазы во фракции нативных митохондрий (в 0,25 М сахарозе) в день выделения.

3. Определяют активность аспартатаминотрансферазы во фракции митохондрий после разрушения мембран действием детергента дигитонина. С этой целью к суспензии нативных митохондрий, содержащей 4 мг белка в 1 мл добавляют 2%-ный раствор дигитонина из расчета 1 мг детергента к 1 мг белка. Суспензию инкубируют при ?°С в течение 10 мин. Действие детергента прекращают 5-кратным разведением 0,25 М сахарозой.

4. Эффективность действия детергента в отношении максимально полного выявления активности аспартатаминотрансферазы митохондрий сопоставляют с деструктивным действием на мембраны процедуры замораживан

страница 177
< К СПИСКУ КНИГ > 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167 168 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227 228 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Скачать книгу "Практикум по биохимии" (5.12Mb)


[каталог]  [статьи]  [доска объявлений]  [прайс-листы]  [форум]  [обратная связь]

 

 

Реклама
шашки магнитные купить
дизайн и декорирование жилых помещений обучение
урна для мусора уличная железная цена
обучение мейкапу юзао

Рекомендуемые книги

Введение в химию окружающей среды.

Книга известных английских ученых раскрывает основные принципы химии окружающей среды и их действие в локальных и глобальных масштабах. Важный аспект книги заключается в раскрытии механизма действия природных геохимических процессов в разных масштабах времени и влияния на них человеческой деятельности. Показываются химический состав, происхождение и эволюция земной коры, океанов и атмосферы. Детально рассматриваются процессы выветривания и их влияние на химический состав осадочных образований, почв и поверхностных вод на континентах. Для студентов и преподавателей факультетов биологии, географии и химии университетов и преподавателей средних школ, а также для широкого круга читателей.

Химия и технология редких и рассеянных элементов.

Книга представляет собой учебное пособие по специальным курсам для студентов химико-технологических вузов. В первой части изложены основы химии и технологии лития, рубидия, цезия, бериллия, галлия, индия, таллия. Во второй части книги изложены основы химии и технологии скандия, натрия, лантана, лантаноидов, германия, титана, циркония, гафния. В третьей части книги изложены основы химии и технологии ванадия, ниобия, тантала, селена, теллура, молибдена, вольфрама, рения. Наибольшее внимание уделено свойствам соединений элементов, имеющих значение в технологии. В технологии каждого элемента описаны важнейшие области применения, характеристика рудного сырья и его обогащение, получение соединений из концентратов и отходов производства, современные методы разделения и очистки элементов. Пособие составлено по материалам, опубликованным из советской и зарубежной печати по 1972 год включительно.

 

 



Рейтинг@Mail.ru Rambler's Top100

Copyright © 2001-2012
(09.12.2016)